補骨脂素通過刺激成肌分化促進骨質疏松性骨折愈合的療效觀察

邱麗玲，金鎮雄，趙永見，侯彤，吳弢，高翔*，唐德志

1.復旦大學附屬華東醫院傷外科，上海200032；2.上海中醫藥大學脊柱病研究所，上海200032

骨質疏松癥是一種常見性疾病，其低骨量和惡化的骨微結構使得骨折發生的可能性增加。流行病學顯示，我國60 歲及以上婦女骨質疏松癥發生率為53.8%，伴隨骨折的發生率為32.6%[1]。骨質疏松癥可造成疼痛和傷殘。在歐洲，每年因骨質疏松性骨折而花費的醫療費用達230 億美元[2]，給社會造成了經濟負擔。

骨折發生后，骨骼和肌肉均會受到損傷，肌肉修復情況會影響骨折愈合質量。Harry 等[3]在骨折實驗中發現，當被肌瓣包圍時，骨修復速度加快。隨著研究深入，研究者們發現肌肉骨骼系統遠比單個組織骨骼或肌肉復雜[4]。有證據表明，骨骼和肌肉之間聯系并不局限機械偶聯，還存在分子水平關聯[5]。骨骼和骨骼肌均可分泌因子對其他組織產生影響[6]。因此理解骨和肌肉之間生化聯系可能給骨疾病治療提供新思路。

傳統理論中，腎虛是骨骼疾病發生的基礎。補骨脂補腎溫脾，補骨脂素（psoralen）為其中有效成分。我們前期研究[1]發現，補骨脂素通過調控BMP 信號通路刺激成骨細胞分化。但是補骨脂素對成肌分化作用尚未有報道，因此，探討補骨脂素對成肌細胞分化的影響，有助于闡明補骨脂素促進骨折愈合的具體機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 上海中醫藥大學動物房訂購2月齡C57BL/6 雄鼠30 只，SPF 級飼養至3月齡。實驗過程中自由飲水進食。許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 實驗試劑和儀器 Micro-CT（SCANCOMedical 公司,瑞士）；蘇木素染色液購自南京建成科技有限公司；Anti-MyoD1 antibody、 Anti- MEF2C antibody、Anti-Myf5 antibody、和Anti-Myogenin antibody 均購自美國abcom 公司；GAPDH Mouse monoclonal antibody (6004-1-lg，美國proteintech 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立骨質疏松模型 3月齡小鼠麻醉后，平鋪在手術臺上。睪丸被推入陰囊后，在陰囊上剪口，結扎并切下睪丸，縫合傷口。

1.3.2 分組：去睪丸后3 個月，隨機分組：補骨脂素組、對照組，每組15 只。

1.3.3 骨折模型建立[7]：骨質疏松術后3月，麻醉后仰臥位，剃凈鼠毛消毒，針頭由脛骨前上處插入下部骨腔，到脛骨下剪斷，抵入脛骨平臺下部分，縫合。術后連續灌胃28d，隔天1 次。

1.3.4 藥物配制（1）將20 mg 補骨脂素溶于20 mL 的玉米油中，震蕩混勻。（2）小鼠劑量=1/70×10×體質量×數量×次數。2 組均以每只0.3 mL/d 藥物或生理鹽水灌胃。

1.3.5 Micro-CT 骨骼樣本固定并沖洗后，使用18 m 分辨率逐層掃描成像。

1.3.6 HE 染色 比目魚肌標本在常規脫水、透明和石蠟包埋后，使用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染液，在光學顯微鏡下觀察骨骼肌愈合情況。

1.3.7 RT-PCR 脛骨后肌中加入Trizol 和鋼珠，震蕩混勻后室溫靜置。加入氯仿，離心吸取上層水相，加異丙醇離心；加DEPC 水并檢測總RNA 濃度及吸光度值。逆轉錄反應生成cDNA。行PCR 反應。引物序列見表1。

1.3.8 Western blotting 將脛骨后肌在液氮冷凍條件下碾成粉，加入RIPA buffer 裂解液，離心收集上清，測蛋白濃度。樣品煮沸，定量上樣后電泳；分離蛋白后轉膜，膜置封閉液中1 h 后,敷一抗過夜；洗膜后二抗孵育并顯色。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白（灰度）/內參GAPDH（灰度），并將所得數據放入Graphpad prism 繪圖。每個實驗樣本均重復3 次。

1.4 統計學處理 采用SPSS20.0 進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩兩比較采用LSDt 檢驗，＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨折斷端Micro-CT 比較 三維重建圖看出，補骨脂素組的小鼠脛骨骨折線基本消失，較多板狀骨痂存在，骨髓腔已通。對照組小鼠骨痂仍有不同程度吸收，骨痂較疏松，見圖1。

2.2 比目魚肌HE 染色結果比較HE 染色顯示，補骨脂素組的肌纖維排列緊密，肌細胞較多。對照組肌纖維排列較疏松，見圖2。

表1 引物序列

2.3 成肌分化相關基因在脛骨后肌中表達情況 提取肌肉組織總RNA，RT-PCR 檢測成肌分化相關基因表達水平。結果發現，與對照組比較，MyoD1、MEF2C、Myf5、Myogenin 成肌分化基因在補骨脂素組中表達上升（＜0.05），見圖3。

2.4 成肌分化相關蛋白在脛骨后肌中表達情況 為了解成肌分化相關蛋白在脛骨后肌中表達情況，對脛骨后肌中這些標志物蛋白水平進行檢測。結果發現，與對照組比較，MyoD1、Myf5、MEF2C、Myogenin 在補骨脂素組中表達上調（＜0.05），見圖4、5。

3 討論

補骨脂素可改善去卵巢小鼠模型骨代謝水平[8]。由于骨質疏松癥實驗受試對象多是去卵巢，雄性動物參與此類實驗少，所以我們選擇雄性動物為觀察對象。另外，由于市面上骨折實驗陽性藥多針對破骨成骨細胞，對成肌分化研究較少，尚無針對成肌分化有說服力陽性藥，因此實驗未增添陽性對照組。

中醫中并無對骨質疏松性骨折明確論述。由于骨折為骨質疏松疾病并發癥，因而可歸為“骨痹”、“骨萎”等范疇。雖傳統文獻無從脾論治記載，但有脾-肌肉-骨緊密聯系的認識。骨肉不相親理論正是對骨骼和肌肉之間關系的概括。腎為先天之本，主骨生髓。腎髓充實滋潤四肢百骸。脾是后天之本，主肌肉和運化水谷。脾功能正常，氣血生化有源，化生津液輸布全身。灌溉五臟六腑，滋潤肌肉骨骼。脾腎失常，骨骼和肌肉失去濡養[8]。一些研究者認為，骨骼與肌肉關系不局限于機械偶聯，還有分子水平聯系[9]。骨可作為內分泌器官釋放骨鈣素等因子，增加未羥丙基化骨鈣素在血液中水平，對肌肉強度產生直接影響[10]。此外，骨細胞分泌的成纖維細胞生長因子23（Fibroblast Growth Factor 23 ，FGF23 ）在血液循環中水平升高導致了心肌肥厚[11]。Hamrick 等[12]利用肌生長抑素缺陷模型研究肌肉質量增加對骨礦物含量的影響。他們發現，肌肉體積增大促進肌因子分泌，進而影響骨量。這些研究為骨與肌肉干擾提供了有力證據。總之，闡細胞（activated satellite cells,ASCs）。QSCs 特征是Pax7 表達，而非MyoG 或MyoD。在增殖過程中，分裂的衛星細胞通過上調MyoG 和下調Pax7，進到分化階段，退出細胞周期，產生成肌細胞并相互融合成肌管，修復受損肌肉[13]。有研究[13]報道，MyoD-/-突變的小鼠由于延遲性肌源分化使肌肉質量減少。另外，這些小鼠體內成肌細胞并不能分化，也不能融合成肌管。這表明MyoD 表達是肌源性分化重要決定因素。成肌分化誘導主要依賴MyoD，其他肌源性調節因子也參與成肌分化。這些因子不僅對ASCs 調控基因表達程序起關鍵作用,而且在骨骼肌微環境中信息處理、肌肉形態等方面有重要影響[14]，因為它們誘導的絕大部分靶基因是肌肉特異性結構和收縮性基因。因而我們選擇MyoD1、MEF2C、Myf5 和Myogenin作為成肌分化標志性因子。

在微環境受到破壞后，激活的骨骼肌衛星細胞不僅可以融合和修復受損的肌纖維，還具有直接或間接的成骨潛力。有研究證實[15]，在沒有肌肉骨骼創傷的情況下，MyoD 的表達僅限于骨骼肌。骨折發生后，MyoD 系肌源性細胞便會被招募到骨損傷的位置，這可能由于骨膜破壞和局部組織創傷。肌肉損傷可促進異位骨形成。研究者使用局部麻醉劑誘導肌肉退化，隨后衛星細胞增殖激活。當肌肉植入脫礦骨基質明膠后發現有較強的骨反應[12]。還有研究者將攜帶骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein,BMP）基因的腺病毒直接注射到比目魚肌中。相關染色反應顯示肌纖維內有較強骨形成標志物受體表達[13]。這表明衛星細胞能夠對BMP 刺激做出反應，從而產生成骨反應。利用這種現象，人們也許可以通過物理或化學方式誘導骨損傷附近肌肉創傷，增加成骨反應。

綜上，本實驗使用去睪丸骨折模型，研究補骨脂素對成肌分化標志性基因的影響，從成肌分化角度動態觀察脛骨和肌肉修復情況。結果表明，補骨脂素提高成肌分化特異性基因表達水平，刺激肌肉修復，加快骨質疏松性骨折骨痂形成。一方面通過刺激衛星細胞分化，加快骨骼肌和骨骼修復。另一方面，補骨脂素補先天精氣、促脾胃運化，使藥物更有效被吸收發揮作用。本研究以中藥改善骨質疏松性骨折患者生活質量為關注點，旨在為醫者提供新思路。然而，本次實驗中也存在一些不足。首先對脛骨標本做了Micro-CT，未有皮質骨和松質骨定量數據，如皮質骨松質骨厚度、骨礦物含量，這些會使實驗更有說服力。其次，藥物劑量單一，補骨脂素促進骨質疏松性骨折愈合和其量效關系之間機制尚不明確，需進一步研究。