砂仁復方對5?FU 所致大鼠腸道損傷的影響

鄭霏艷 孫瑞芬 龔建瑜 陳 鑫 趙榮華 李 菊?

（1.云南省疾病預防控制中心， 云南 昆明650022； 2.云南中醫藥大學， 云南 昆明650500）

惡性腫瘤威脅著全人類的健康，在我國腫瘤導致的死亡占全部死因的1／4，治療手段以手術和放化療為主。五氟尿嘧啶（5?fluorouracil，5?FU）是臨床上常用的化療藥物，但其應用常伴隨有骨髓抑制、胃腸道反應、肝損害、泌尿生殖系統毒性、脫發等不良反應［1］，以胃腸道反應為主，如何改善這一現象，成為了腫瘤化療中的重要課題。

祖國醫學博大精深，尤其在治療胃腸道方面疾病時有不可替代的優勢。砂仁復方是以砂仁為主要藥材，輔以人參、滇黃精制成，方中砂仁具有行氣調中、和胃醒脾的功效，在臨床上具有保護胃黏膜、改善胃腸機能、止痛、止瀉、促進消化液的分泌等作用［2?3］；人參具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津止渴、安神益智的功效［4］，現代藥理學研究證明它有提高機體免疫力、抗腫瘤、抗炎、殺菌等作用［5］；滇黃精具有滋腎潤肺、補脾益氣的功效［6］，全方對5?FU 導致的胃腸道功能損傷可能具有保護作用，但尚無確切的研究證明。本實驗利用5?FU 建立大鼠腸道功能損傷模型，研究砂仁復方對大鼠腸道功能損傷的保護作用，為臨床腫瘤治療中5?FU 應用提供支撐，為該方開發利用提供一定科學依據，同時也為云南砂仁產業化發揮推動作用。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，清潔級，雄性，體質量180～200 g，購自昆明醫科大學實驗動物學部，生產許可證號SCXK（滇）k2015?002。

1.2 試劑與藥物 砂仁復方相關生藥均購自昆明螺獅灣中藥材市場，經云南中醫藥大學趙榮華教授鑒定為正品。雙歧桿菌四聯活菌片（杭州遠大生物制藥有限公司，批號201703101）；5?FU（北京華邁科生物技術有限責任公司，批號BJ160513212A）；二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，貨號P1511）；高效細胞組織裂解液（radio?immunoprecip?itation assay，RIPA，北京索萊寶科技有限公司，貨號R0010）；Anti?occludin 抗體（英國Abcam 公司，貨號ab167161）；Anti?Claudin?1 抗體（英國Abcam公司，貨號ab15098）；Anti?Alpha tubulin 抗體（英國Abcam 公 司，貨 號5335）；辣根過 氧化物 酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobin G，IgG）二 抗（美 國Cell Signaling Technology 公司，貨號7074）；抗?甘油醛?3?磷酸脫氫酶（Anti?glyceraldehyde?3?phosphate dehydro?genase，Anti?GAPDH）抗體（美國Proteintech 公司，貨號10494?1?AP）；電化學發光（electrochemilumines?cence，ECL）檢測試劑（德國Merck Millipore 公司，貨號WBKLS0050）。

2 方法

2.1 砂仁復方溶液的制備 砂仁復方為砂仁、滇黃精、人參按1 ∶1 ∶1 比例配伍而成，滇黃精用其提取液制成每1 mL 含1 g 生藥的流浸膏備用，砂仁、人參分別粉碎過100 目篩備用。根據砂仁復方人服用每日劑量，折算大鼠的等效劑量約為1.6 g生藥／kg，為本實驗的中劑量，同時分別以0.8、3.2 g 生藥／kg 作為低劑量、高劑量。再配制0.32 g／mL砂仁復方高劑量藥液、0.16 g／mL 砂仁復方中劑量藥液、0.08 g／mL 砂仁復方低劑量藥液。

2.2 分組、造模及給藥 雄性SD 大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性（思連康）組及砂仁復方低、中、高劑量組，每組8 只。動物模型參照課題組前期實驗研究及郭炳勛［7］、杜靜等［8］報道的方法，空白組每天灌胃生理鹽水（1 mL／100 g）1 次至第19 天；模型組除每天灌胃生理鹽水至第19 天外，于第8、14 天灌胃生理鹽水4 h 后腹腔注射5?FU（35 mg／kg）1 次。陽性組每天灌胃生理鹽水至第7 天，第8 天灌胃思連康溶液（0.45 g／kg），每天1 次，至第19 天，于第8、14 天給藥4 h 后腹腔注射5?FU（35 mg／kg）1 次；砂仁復方低、中、高劑量組每天灌胃相應劑量的藥液1 次，于第8、14 天給藥4 h 后腹腔注射5?FU（35 mg／kg）1 次。每天測量大鼠飲食量、體質量，觀察其狀態和活動情況，體質量增量＝體質量第19天-體質量第1天。

2.3 HE 染色 每組隨機抽取3 只大鼠，處死后取回腸，于10% 中性福爾馬林中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精?伊紅染色，中性樹膠進行封片，觀察各組織切片形態，測量小腸絨毛高度及隱窩深度。

2.4 Western blot 檢測

2.4.1 總蛋白的提取、測定和變性 取小腸組織，磷酸緩沖鹽溶液快速清洗，稱定質量，每1 mg 加入1 mL 細胞組織裂解液（RIPA），置玻璃勻漿器中快速勻漿，冰上裂解0.5 h，離心（13 000 r／min、4 ℃）20 min，收集上清，即得小腸組織總蛋白。蛋白定量采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒，按照說明書操作步驟進行，利用酶標儀在562 nm 波長處測定小腸組織總蛋白含有量，提取液按1 ∶1比例加入電泳樣品緩沖液，于95 ℃水浴鍋中煮5 min進行變性。

2.4.2 Western blot 制備含10%分離膠、5%濃縮膠的15 孔1.2 mm 聚丙烯酰胺凝膠（dodecyl sulfate，sodium salt?polyacrylamide gel electrophoresis，SDS?PAGE）。蛋白液按空白組、模型組、陽性組及砂仁復方低、中、高劑量組順序依次上樣，兩邊分別加入4 μL 標記（marker），80 V 電泳2 h，120 V 轉膜2 h 到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，PVDF 膜于室溫搖床上用5%脫脂奶粉?三甲胺?生理鹽水和吐溫20 緩沖液（tris?buffered saline and Tween 20，TBST）于搖床上振搖均勻封閉2 h，封閉后用TBST 緩沖液洗滌3 次（5 min／次），加入一抗4 ℃孵育過夜，第2 天用TBST 洗膜3 次（5 min／次），再加入偶聯的二抗，于室溫搖床上孵育1.5 h，用TBST 洗膜3 次（5 min／次）后用ECL顯影液顯影，凝膠成像儀拍照。采用Quantity One軟件對條帶進行光密度分析，以目的蛋白光密度與內參蛋白光密度比值代表目的蛋白的相對含有量。

2.5 統計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行處理，數據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用最小顯著性差異法（least sig?nificant difference，LSD）檢驗，方差不齊者采用Tamhane’s 法檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 砂仁復方對大鼠體質量的影響 如表1 所示，模型組體質量增量低于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，砂仁復方各劑量組體質量增量無明顯變化（P＞0.05）。

表1 各組大鼠體質量增量（， n＝8）Tab.1 Weight gain of rats in each group（， n＝8）

表1 各組大鼠體質量增量（， n＝8）Tab.1 Weight gain of rats in each group（， n＝8）

注：與空白組比較，△P＜0.05。

3.2 砂仁復方對大鼠回腸病理形態學及絨毛高度的影響 如圖1 所示，空白組腸絨毛結構清晰、完整，黏膜下層、肌層完整，無炎細胞浸潤；模型組腸絨毛斷裂嚴重、結構改變，炎性細胞浸潤至黏膜下層，形成潰瘍，部分炎性細胞浸潤至肌層，杯狀細胞消失；陽性組腸絨毛結構破壞，炎細胞浸潤至黏膜下層、部分腸上皮細胞；砂仁復方低劑量組腸絨毛結構部分改變、絨毛部分斷裂，黏膜下層有炎細胞浸潤，部分肌層增生；砂仁復方中劑量組中腸絨毛結構部分改變、斷裂，黏膜下層炎性細胞浸潤；砂仁復方高劑量組炎性細胞不同程度浸潤至腸絨毛、黏膜下層，上皮細胞脫落。

圖1 HE 染色檢測各組大鼠回腸組織病理學（×10）Fig.1 Histopathological detection of rat ilea in each group by HE staining（×10）

如表2 所示，空白組小腸絨毛高度大于模型組（P＜0.01），砂仁復方各劑量組小腸絨毛高度均大于模型組（P＜0.05，P＜0.01），初步表明砂仁復方對5?FU 所致大鼠回腸絨毛降低具有調節作用。

表2 各組大鼠小腸絨毛高度（， n＝3）Tab.2 Intestinal villus heights of rats in each group（，n＝3）

表2 各組大鼠小腸絨毛高度（， n＝3）Tab.2 Intestinal villus heights of rats in each group（，n＝3）

注：與空白組比較，△△P ＜0.01；與模型組比較，?P ＜0.05，??P＜0.01。

3.3 砂仁復方對大鼠小腸隱窩深度的影響 如表3 所示，空白組小腸隱窩深度大于模型組（P＜0.05）；陽性組、模型組小腸隱窩深度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；砂仁復方低、中、高劑量組小腸隱窩深度大于模型組（P＜0.05），初步表明砂仁復方對5?FU 所致大鼠回腸隱窩深度降低具有調節作用。

表3 各組大鼠小腸隱窩深度（， n＝3）Tab.3 Depths of small intestinal crypts of rats in each group（， n＝3）

表3 各組大鼠小腸隱窩深度（， n＝3）Tab.3 Depths of small intestinal crypts of rats in each group（， n＝3）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05。

3.4 砂仁復方對大鼠腸道緊密連接occludin 蛋白表達的影響 如圖2 所示，與空白組比較，模型組occludin 表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，砂仁復方各劑量組occludin 蛋白表達升高（P＜0.01），初步表明5?FU 腹腔注射致大鼠occludin 表達降低，而砂仁復方對其具有調高作用。

圖2 砂仁復方對大鼠腸道組織occludin 蛋白表達的影響Fig.2 Effect of AVLC on the expression of occludin protein in intestinal tissue of rats

3.5 砂仁復方對大鼠腸道緊密連接Claudin?1 蛋白表達的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組Claudin?1 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，砂仁復方中劑量組（P＜0.05）、高劑量組（P＜0.01）Claudin?1 蛋白表達升高。

4 討論

化療是腫瘤治療的主要手段之一，但相關藥物的毒副作用影響著化療能否順利進行，而胃腸道反應是常見的不良反應之一。目前研究發現，化療藥物可直接損傷腸黏膜上皮細胞，引起腸上皮細胞損傷、凋亡；影響細胞增殖，阻礙腸黏膜修復；引起免疫細胞數量變化，導致免疫調控異常［9?10］，在能使用的藥物中，很少有能夠達到有效拮抗化療后胃腸損傷的效果。化療藥物對胃腸損傷的機制比較復雜，本研究中陽性藥思連康是一種復方制劑，其主要成分為雙歧桿菌、糞腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌，部分是人體腸道空白的腸菌群，可直接補充機體空白生理細菌，在腸道形成一個生物屏障，繼而促進腸道蠕動，緩解臨床癥狀以調節胃腸功能［11］，但可能因其對胃腸道保護作用單一，導致在整個化療藥對胃腸損傷實驗中保護性作用微弱。結果，思連康在調節隱窩深度、絨毛高度等方面都有一定積極作用，但未達到統計學差異。

圖3 砂仁復方對大鼠腸道組織Claudin?1 蛋白表達的影響Fig.3 Effect of AVLC on the expression of Claudin?1 protein in intestinal tissue of rats

體質量直接顯示胃腸道功能的高低，也是治療惡性腫瘤的臨床療效指標之一，可間接反映腫瘤患者的生存質量［12］。模型組體質量增量低于空白組；砂仁復方各劑量組體質量增量與模型組比較，差異無統計學意義；砂仁復方中劑量組對5?FU 所致大鼠體質量增量降低，具有一定調節作用。所以，進一步進行砂仁復方有效化合物的提取、純化，增加有效成分的血藥濃度，有望能達到有效調節體質量的目的，但高、低劑量調節作用較弱，可能是因為低劑量達不到有效血藥濃度，而高劑量表現出一定的不良反應。

小腸絨毛是吸收營養物質的主要部位，腸絨毛的高低決定著絨毛上皮細胞數量的多少，進而影響營養物質的吸收［13］；隱窩深度反映了上皮細胞的生成率，上皮細胞不斷從隱窩基部向絨毛端部遷移、分化，形成具有吸收能力的絨毛細胞，以補充空白的脫落［14］，因此，腸絨毛高度及隱窩深度一定程度間接反映了腸道的結構和功能。空白組小腸絨毛高度、隱窩深度顯著高于模型組，砂仁復方各劑量組也均顯著高于模型組，初步表明砂仁復方對化療藥5?FU 所致大鼠回腸絨毛降低具有明顯調節作用，其途徑可能是通過對腸道生理功能及屏障功能的恢復，增加腸道對體內儲留的代謝物的排出，以低、中劑量調節作用最顯著，這可能與砂仁揮發油成分可通過對抗胃腸黏膜的攻擊因子來產生胃腸保護作用有關［15］。

本研究發現，模型組小腸緊密連接occludin 蛋白表達顯著低于空白組，砂仁復方各劑量組其表達均明顯高于模型組，表明5?FU 腹腔注射致大鼠oc?cludin 蛋白表達降低，而砂仁復方對其具有明顯調高作用；模型組中Claudin?1 蛋白表達低于空白組，砂仁復方中劑量組、高劑量組中其表達明顯高于模型組。腸道黏膜屏障主要由上皮細胞和細胞間緊密連接構成，是阻礙有害物質進入機體的重要屏障［16］，腸道緊密連接主要位于腸上皮細胞頂端表面，是上皮細胞間連接最為重要的結構復合物，在維持腸黏膜的屏障功能方面發揮著重要的作用，多種蛋白參與了緊密連接的形成，包括Claudin、oc?cludin 等，因此，腸道緊密連接蛋白被用來作為評價腸道黏膜屏障和腸道通透性的指標［17?18］。結果顯示，砂仁復方可以增加多種蛋白的表達，參與腸道緊密連接結構的形成，為胃腸道損傷提供保護。

綜上所述，砂仁復方可以從多方面、多層次調節5?FU 所致大鼠腸道功能的損傷作用，為該方開發應用提供了科學依據。但本實驗只進行了調節胃腸道作用的初步研究，今后還需深入系統地探索。