銀杏酮酯片中萜內(nèi)酯、黃酮苷整合溶出度的測定

江美芳 高 崎 王丹丹

（上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司， 上海201210）

銀杏葉是我國傳統(tǒng)中藥，其成分主要包括黃酮、萜內(nèi)酯、烷基酚、羧酸等，其中黃酮、萜內(nèi)酯是主要活性物質(zhì)［1?2］。銀杏酮酯（GBE50）是新一代銀杏葉提取物，總黃酮、萜內(nèi)酯類質(zhì)量分?jǐn)?shù)可提高到50%以上，臨床上被廣泛用于治療血瘀型胸痹及血瘀型輕度腦動脈硬化引起的眩暈、冠心病、心絞痛等心血管疾病［3?4］。

體外溶出度是模擬口服固體制劑在胃腸道中的崩解和溶出情況、評價(jià)制劑活性成分的生物利用度和藥物質(zhì)量的內(nèi)在指標(biāo)［5?6］，目前常見評價(jià)方法主要以單一［7］或多種［8］成分為指標(biāo)進(jìn)行體外溶出度研究［9?10］，難以反映中藥組分的整體體外溶出情況。近年來，研究人員提出質(zhì)量權(quán)重系數(shù)法來研究中藥多組分溶出度［11?12］，從而反映中藥整體溶出，但目前國家標(biāo)準(zhǔn)中銀杏酮酯片只有崩解時(shí)限的檢測，尚未涉及其溶出度。因此，本實(shí)驗(yàn)通過質(zhì)量權(quán)重系數(shù)法來研究銀杏酮酯片多組分整合溶出度以表征該制劑整體溶出情況，以期為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升奠定基礎(chǔ)，也為中藥制劑體內(nèi)外釋放評價(jià)和整體性質(zhì)研究提供新的思路和參考。

1 材料

Waters Xevo G2?XS Q?TOF·ESI 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters 公司）；Rcz 6C3 溶出度儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；FE28 PH 計(jì)（瑞士梅特勒?托利多公司）；SQPQUINTIX65?1CN 電子分析天平（德國Sartorius 公司）。銀杏內(nèi)酯A（批號W25A7K13730）、銀杏內(nèi)酯C（批號C28S6G3986）、白果內(nèi)酯（批號P08J9F52398）、蘆丁（批號 Y16M9S61523 ）、異鼠李 素?3?O?葡萄糖（批 號Y09J9H52567 ）、山柰酚?3?O?蕓香糖（批 號Y15N8H48277）、香蒲新苷（批號Y1458H43976）對照品（上海源葉生物科技有限公司）；銀杏內(nèi)酯B 對照品（批號110863?201611，中國食品藥品檢定研究院）；異槲皮苷對照品（批號2183／17872，上海詩丹德生物技術(shù)有限公司）。銀杏酮酯片（批號171002，上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 萜內(nèi)酯、黃酮苷含有量測定

2.1.1 UPLC?MS 條件

2.1.1.1 色譜 Waters AcQuityTMUPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）?甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，98%～25% A；10～10.5 min，25%～2% A；10.5～13 min，2% A；13～13.5 min，2%～98%A；13.5～15 min，98% A）；體積流量0.4 mL／min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.1.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子條件下采用Sensitivity 模式，掃描時(shí)間15 min；毛細(xì)管電壓2.5 kV；離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣體積流量800 L／h，溫度400 ℃；錐孔電壓35 V；萃取電壓4.0 V。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素?3?O?葡萄糖、山柰酚?3?O?蕓香糖、香蒲新苷對照品適量，二甲基亞砜制成各成分質(zhì)量濃度約為1 mg／mL 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取片劑20 片，研磨成粉，稱取100 mg，5 mL 50%甲醇超聲提取10 min，10 000 r／min 離心10 min，取上清液，重復(fù)3 次，合并上清液，用50% 甲醇定容至25 mL 量瓶中，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2” 項(xiàng)下對照品溶液適量，50%甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下各進(jìn)樣1 μL 測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.1.5 專屬性試驗(yàn) 根據(jù)片劑處方稱取空白輔料適量，按比例制成陰性制劑，再按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分之間互不影響，輔料無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分提取離子流色譜圖

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定6 次，測得各成分峰面積RSD 分別為銀杏內(nèi)酯B 2.63%、銀杏內(nèi)酯A 2.42%、銀杏內(nèi)酯C 2.20%、白果內(nèi)酯1.98%、蘆丁1.26%、異槲皮苷1.59%、異鼠李素?3?O?葡萄糖1.55%、山柰酚?3?O?蕓香糖1.37%、香蒲新苷1.39%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品溶液6 份，于0、2、4、8、12 h在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得各成分峰面積RSD 分別為銀杏內(nèi)酯B 2.89%、銀杏內(nèi)酯A 2.46%、銀杏內(nèi)酯C 3.06%、白果內(nèi)酯2.40%、蘆丁2.55%、異槲皮苷2.54%、異鼠李素?3?O?葡萄糖2.05%、山柰酚?3?O?蕓香糖2.13%、香蒲新苷2.20%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取片劑適量，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得各成分含有量RSD 分別為銀杏內(nèi)酯B 1.69%、銀杏內(nèi)酯A 1.69%、銀杏內(nèi)酯C 2.18%、白果內(nèi)酯2.45%、蘆丁1.12%、異槲皮 苷1.06%、異鼠李素?3?O?葡萄糖3.40%、山柰酚?3?O?蕓香糖1.41%、香蒲新苷3.82%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 測定結(jié)果 取 “2.1.3” 項(xiàng)下供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量。結(jié)果，每片中各成分含有量RSD 分別為銀杏內(nèi)酯B 0.21%、銀杏內(nèi)酯A 0.47%、銀杏內(nèi) 酯C 0.16%、白果內(nèi) 酯0.72%、蘆 丁0.44%，異槲皮苷0.11%，異鼠李素?3?O?葡萄糖0.012%、山柰酚?3?O?蕓香糖0.29%、香蒲新苷0.054%。

2.2 溶出度測定 取片劑6 片，采用2015 年版《中國藥典》 附錄溶出度測定第二法槳法，將其置于溶出儀中，以500 mL 緩沖液（pH ＝1.2）為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r／min，溫 度37 ℃，平 行5 份，在5、15、30、45、60、90、120 min各取樣3 mL，3 mL 空白緩沖液補(bǔ)足體積，溶出液在6 000 r／min 下離心10 min，取上清液，緩沖液稀釋10倍，作為樣品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算溶出度，繪制累積釋放曲線，結(jié)果見圖2。由此可知，在30 min 時(shí)銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素?3?O?葡萄糖、山柰酚?3?O?蕓香糖、香蒲新苷溶出度分別為96%、94%、94%、100%、99%、93%、97%、97%、104%，表明其溶出性良好。

圖2 萜內(nèi)酯、黃酮苷累積釋放曲線

2.3 溶出曲線整合模型建立 本實(shí)驗(yàn)引入以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)［13?14］，選擇成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為整體單位，權(quán)重系數(shù)為各成分、總成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值。假設(shè)總成分中有n種成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為a、b、c、d…，總成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為ω，各成分權(quán)重系數(shù)ψ、組分整體性質(zhì)值δ計(jì)算公式分別為ψ＝n／ω＝100%，其中A、B、C…代表各成分性質(zhì)值。結(jié)果，銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素?3?O?葡萄糖、山柰酚?3?O?蕓香糖、香蒲新苷權(quán)重系數(shù) 分別為0.085、0.191、0.065、0.292、0.178、0.045、0.005、0.118、0.022。

將每個時(shí)間點(diǎn)各成分累積溶出度賦以相應(yīng)權(quán)重系數(shù)，計(jì)算其整合累積溶出度，并繪制整合溶出曲線，結(jié)果見圖3。由此可知，片劑整體溶出性較好，在30 min 時(shí)溶出度達(dá)到97.97%，與各成分本身溶出行為相似。

圖3 片劑整合溶出曲線

2.4 溶出曲線相似性分析 近年來，f2相似因子法作為定量描述體外溶出曲線相似性的非模型依賴方法［15?16］，因其計(jì)算簡單、判定方法可靠，已被美國FDA 的CDER（藥品評價(jià)和研究中心）和歐盟的EMEA（歐盟藥品審評局）推薦使用［17?18］，廣泛用于受試試劑與參比制劑之間的溶出曲線相關(guān)性研究［19］。f2＝50lg其中Ri、Ti分別為參比制劑、受試制劑在各時(shí)間點(diǎn)的釋放度，n為時(shí)間點(diǎn)個數(shù)，對于2 條溶出曲線而言，如果其f2≥50，則認(rèn)為兩者相似，反之則不相似。結(jié)果，銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素?3?O?葡萄糖、山柰酚?3?O?蕓香糖、香蒲新苷f2分別為77、77、74、70、76、64、70、77、55，表明整合溶出曲線與各成分溶出曲線均相似，相關(guān)性良好，可客觀反映片劑整體溶出情況。

3 討論與結(jié)論

銀杏酮酯片在模擬胃酸的pH 1.2 緩沖液中30 min 時(shí)，其所含各成分溶出度及整合溶出度均達(dá)到90%以上，即在該緩沖液中能較快溶出。再通過f2相似因子法進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)整合溶出曲線與各單體成分溶出曲線具有較好的相關(guān)性，能反映銀杏酮酯片體外整體溶出情況。

將銀杏酮酯片分別置于pH1.2、pH4.5、水（pH6.4）、pH8.0 的溶出介質(zhì)中20 min 時(shí)發(fā)現(xiàn)，該制劑在堿性條件下溶出度小，而在酸性條件下溶出度大，故選擇pH 為1.2；分別在50、75、100 r／min 下處理20 min 時(shí)發(fā)現(xiàn)，它在100 r／min下溶出度最大，故選擇其作為轉(zhuǎn)速。另外，在槳法溶出度研究中常用溶出體積有500、900、1 000 mL［20?22］，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)考察后選擇500 mL。

通過UPLC?Q?TOF／MS 法對銀杏酮酯片50%甲醇提取液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素?3?O?葡萄糖、山柰酚?3?O?蕓香糖、香蒲新苷含有量相對較高，苷元包括槲皮素、異鼠李素、山柰酚，苷包括單糖、雙糖、三糖苷，基本覆蓋了黃酮苷絕大部分構(gòu)型；銀杏內(nèi)酯A、B、C 及白果內(nèi)酯為萜內(nèi)酯中的主要有效成分，含有量也較高。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇上述成分作為指標(biāo)。

目前，主要通過HPLC 法（配置ELSD、UV 檢測器）檢測萜內(nèi)酯、黃酮醇；本實(shí)驗(yàn)采用LC?MS 法同時(shí)測定上述2 種成分的含有量，可簡化樣品前處理過程，減少分開檢測的繁瑣程序，并且能增加靈敏度，避免成分因其溶出度低而未被檢測出或引起較大誤差。