黃芪桂枝五物湯提取工藝的優(yōu)化

孫 興 陳 旺 阮 佳王美慧譚 鐳詹 雁徐超群?

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院， 四川 成都610075； 2.四川省中醫(yī)藥科學院， 四川 成都610041）

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病常見并發(fā)癥，具有高致殘率和致死率［1］，其癥狀表現(xiàn)和病機與中醫(yī)“血痹” 范疇吻合［2］，臨床研究表明，黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變有較好的治療作用［3?4］，由黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗配伍而成，具有補益氣血、溫通衛(wèi)陽、散寒除痹之功效，被收錄于國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》［5］。

質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）的核心是確定制藥過程中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性和關(guān)鍵工藝參數(shù)，并通過建立工藝模型來確定關(guān)鍵工藝參數(shù)與關(guān)鍵質(zhì)量屬性的關(guān)系，以此構(gòu)建設(shè)計空間，對藥品進行質(zhì)量控制［6?7］。本研究基于QbD 理念，應(yīng)用風險分析、Box?Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪桂枝五物湯提取工藝，并建立相應(yīng)設(shè)計空間，以期為該方進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置Agilent 1260 DAD檢測器、Agilent 1260 Infinity ⅡELSD 檢測器（美國Agilent公司）；UV?2401PC 紫外分光光度計（日本島津公司）；XS205 電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；SB?5200D 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ZDHW 調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。黃芪甲苷（110781?201717）、D?無水葡萄糖（110833?201508）對照品均購于中國食品藥品檢定院；芍藥苷（17102709）對照品購于四川省維克奇生物科技有限公司。黃芪（批號1805070）、桂枝（批號1805124）、白芍（批號1806008）、大棗（批號1806141）均購于四川新荷花飲片股份有限公司，生姜購于成都荷花池中藥材市場，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學院舒光明研究員鑒定為正品，符合2015 版《中國藥典》一部規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液制備 按照《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中黃芪桂枝五物湯的處方組成及漢代劑量換算［8?9］，稱取黃芪41.4 g、桂枝41.4 g、白芍41.4 g、生姜41.4 g、大棗12 枚，按照一定參數(shù)進行提取，趁熱濾過，減壓濃縮并定容至100 mL 量瓶中，即得。

2.2 黃芪甲苷含有量測定

2.2.1 色譜條件 ZORBAX SB?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈?水（33 ∶67）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL，蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）；漂移管溫度45 ℃；氮氣體積流量1.0 mL／min。理論塔板數(shù)以黃芪甲苷計不低于5 000，分離度＞1.5，陰性無干擾，色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成該成分質(zhì)量濃度為0.98 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密量取“2.1” 項下提取液25 mL，加入40 mL 水飽和正丁醇萃取4 次，合并正丁醇液，氨試液充分洗滌2 次，每次50 mL，棄去氨液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取對照品溶液，甲醇依次稀釋成0.098、0.196、0.392、0.588、0.784 mg／mL，各精密吸取20 μL，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以進樣量對數(shù)值為橫坐標（X），峰面積對數(shù)值為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝1.709 9X＋1.592 5（r＝0.999 6），在0.098～0.784 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 黃芪甲苷HPLC 色譜圖

2.2.5 精密度試驗 取同一份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得黃芪甲苷峰面積RSD 為1.85%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得黃芪甲苷峰面積RSD 為1.54%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一份提取液，按“2.2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得黃芪甲苷含有量RSD 為1.12%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取黃芪甲苷含有量已知的提取液25 mL，共6 份，精密加入對照品溶液（含黃芪甲苷0.98 mg／mL）3 mL，按“2.2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得黃芪甲苷平均加樣回收率為99.11%，RSD 為0.98%。

2.3 芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸含有量測定

2.3.1 色譜條件 ZORBAX SB?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～26 min，12%～13% A；26～30 min，13% A；30～48 min，13%～24% A；48～58 min，24% A；58～65 min，24%～44%A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；DAD 檢測器，檢測波長230 nm（0～25 min，芍藥苷）、260 nm（25～50 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、285 nm（50～65 min，肉桂酸）；進樣量10 μL；理論塔板數(shù)以各成分計不低于5 000，分離度＞1.5，陰性無干擾，色譜圖見圖2。

圖2 各成分HPLC 色譜圖

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸對照品適量，置于量瓶中，甲醇制成三者質(zhì)量濃度分別為7.570、1.156、1.282 mg／mL 的貯備液，分別精密吸取2、1、1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 精密量取“2.1” 項下提取液2 mL 至10 mL 量瓶中，加 入50% 甲醇7 mL 超聲處 理10 min，放冷，50%甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.2、0.5、1、2、4 mL 至5 mL 量瓶中，甲醇制成不同質(zhì)量濃度，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程分別為芍藥苷Y＝13 074X-262.67（r＝0.999 9），線性范圍60.560～1 211.200 μg／mL；毛蕊異 黃酮葡 萄糖苷Y＝27 179X-0.127 6（r＝0.999 9），線性范 圍4.624～92.480 μg／mL；肉桂酸Y＝82 630X-42.623（r＝0.999 9），線性范圍5.124～102.480 μg／mL。

2.3.5 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸峰面積RSD 分別為0.28%、0.17%、0.27%、表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸峰面積RSD 分別為0.18%、0.12%、0.67%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取同一份提取液，按“2.3.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸含有量RSD 分別為0.90%、0.46%、0.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密量取各成分含有量已知的提取液1 mL，共6 份，精密加 入對照 品溶液（含芍藥 苷7.570 mg／mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.115 6 mg／mL、肉桂酸0.256 4 mg／mL）各0.5 mL，按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸平均加樣回收率分別為100.15%、99.87%、99.91%，RSD 分別為1.02%、1.43%、1.51%。

2.4 總多糖含有量測定

2.4.1 對照品溶液制備 精密稱取D?葡萄糖對照品適量，加水制成該成分質(zhì)量濃度為1.420 2 mg／mL 的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液制備 精密量取“2.1” 項下提取液5 mL，加水定容至10 mL，搖勻，加入Sevag 試劑2 mL，振搖后離心收集上清液，重復(fù)操作至無沉淀，取上清液2 mL，加入5 倍量乙醇，冰箱中靜置過夜后離心（4 000 r／min）10 min，沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，搖勻，精密量取5 mL 于50 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密吸取0.5、1、1.5、2、2.5 mL對照品溶液，加水定容至50 mL 量瓶中，各取2 mL 至具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入5 mL 濃硫酸，混勻，于80 ℃水浴中保溫15 min，取出，置于冰水中冷卻，以相應(yīng)試劑為空白，在485 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標（A），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為A＝0.017 6X＋0.017 1（r＝0.999 1），在14.20～71.02 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 精密度試驗 取同一份供試品溶液，按“2.4.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為0.10%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于10、20、30、60、90 min 按“2.4.3” 項下方法測定吸光度，測得其RSD 為0.50%，表明溶液在90 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗 精密量取供試品溶液6 份，按“2.4.3” 項下方法測定吸光度，測得其RSD 為1.82%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗 精密量取D?葡萄糖含有量已知的供試品溶液、對照品溶液各1 mL，按“2.4.3” 項下方法測定吸光度，測得總多糖平均加樣回收率為98.94%，RSD為1.32%。

2.5 干膏率、提取率測定 精密吸取提取液10 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃下干燥至恒重，精密稱定質(zhì)量，計算干膏率，公式為干膏率＝（干膏質(zhì)量／處方藥材質(zhì)量）×100%。按“2.2” 至“2.4” 項下方法分別測定黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、肉桂酸、總多糖含有量，計算提取率，公式為提取率＝（各成分含有量／處方藥材質(zhì)量）×100%。

2.6 綜合評分計算 首先按照表1 評分標準比較各指標相對重要性，構(gòu)建成對比較的優(yōu)先判斷矩陣，見表2。計算初始權(quán)重，公式為，再計算權(quán)重W，公式為，測得黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、總多糖、芍藥苷、肉桂酸提取率及干膏率的權(quán)重系數(shù)分別 為0.290 0、0.290 0、0.172 6、0.101 6、0.101 6、0.044 1。參考文獻［11］，測得一致性比列因子CR（CI／RI，CI 為一致性指標，RI 為平均一致性指標）為0.028 9＜0.10，表明判斷矩陣具有一致性，權(quán)重系數(shù)合理有效。最后計算綜合評分，公式為綜合評分＝ ［（黃芪甲苷提取率／最大提取率）×0.290 0＋（毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率／最大提取率）×0.290 0 ＋（總多糖提取率／最大提取率）×0.172 6＋（芍藥苷提取率／最大提取率）×0.101 6＋（肉桂酸提取率／最大提取率）×0.101 6＋（干膏率／最大干膏率）×0.044 1］×100。

表1 各層次評分標準

表2 指標成對比較的優(yōu)先判斷矩陣

2.7 風險評估 根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗結(jié)合魚骨圖分析確定影響提取工藝的潛在關(guān)鍵工藝參數(shù)，見圖3，再采用失效模式與效應(yīng)（FMEA）對其進行定量風險分析，從嚴重程度（S）、發(fā)生頻度（P）、檢查的難易程度（D）3 個方面進行評估［12］，評分原則見表3，最后根據(jù)評分結(jié)果計算各因素風險優(yōu)先度（RPN，S×P×D），大于10 的為高風險因素，可被識別為關(guān)鍵工藝參數(shù)［13］，結(jié)果見表4。由此可知，提取次數(shù)、提取時間、溶劑用量為關(guān)鍵工藝參數(shù)。

圖3 提取工藝魚骨圖

表3 S、P、D 評分原則

2.8 Box?Behnken 響應(yīng)面法 按處方比例稱取藥材3 份，加入1 000 mL 水，室溫下放置2 h，發(fā)現(xiàn)在70 min 時藥材全部浸潤，吸液率約為藥材質(zhì)量的1 倍，因此在第1 次提取時多加1 倍量水浸泡1 h。

采用Box?Behnken 響應(yīng)面法，選擇提取時間（A）、提取次數(shù)（B）、溶劑用量（C）作為影響因素，黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、肉桂酸、總多糖提取率及干膏率作為評價指標，按“2.6” 項下公式計算綜合評分，結(jié)果見表5。通過Design?Expert 8.0 軟件進行二次多項式擬合，得到回歸方程為綜合評分＝75.63 ＋3.03A＋19.07B＋4.96C-0.14AB＋1.01AC＋2.55BC-2.26A2-6.13B2-2.03C2，R2＝0.964 4，Radj2＝0.918 7，表明模型具有良好的擬合度。

表4 FMEA 風險評估結(jié)果

表5 試驗設(shè)計及結(jié)果

方差分析見表6。由此可知，模型P＜0.01，失擬項P＞0.05，表明模型具有顯著意義；信噪比S／N＞4，表明模型預(yù)測精密度良好；各因素影響程度依次為B＞C＞A，其中因素C、B2有顯著影響（P＜0.05），B有極顯著影響（P＜0.01）。

表6 方差分析

響應(yīng)面分析見圖4。由此可知，因素B對綜合評分的影響程度大于A、C，與表6 一致；在一定范圍內(nèi)提取次數(shù)越多，提取時間越長，溶劑用量越大，綜合評分越高。

圖4 各因素響應(yīng)面圖

通過Design?Expert 8.0 軟件，根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量要求設(shè)定綜合評分目標范圍大于85，建立提取工藝的設(shè)計空間，由于預(yù)測值與真實值之間存在一定差異，故加入α ＝0.05 的置信空間以提高準確度［14］，結(jié)果以O(shè)verlay Plot 展示，見圖5。由此可知，優(yōu)化區(qū)域內(nèi)的點均滿足設(shè)計要求，而風險區(qū)域內(nèi)的點有5%不滿足。

選取5 個區(qū)域內(nèi)的實驗點進行驗證試驗，結(jié)果見表7。由此可知，預(yù)測值與實驗值的偏差均小于5%，表明該模型預(yù)測能力良好；設(shè)計空間、置信區(qū)間內(nèi)的點均能滿足預(yù)期目標，而設(shè)計空間外的點均不滿足，表明該設(shè)計合理可行。基于生產(chǎn)成本考慮，確定提取工藝的最優(yōu)設(shè)計空間為提取時間60～78 min，提取次數(shù)3 次，溶劑用量10.5～11.5 倍。

3 討論

3.1 評價指標篩選 在黃芪桂枝五物湯中，黃芪、白芍主要活性成分黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷均有增加胰島素敏感性、降血糖、神經(jīng)保護作用，可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥［15?19］；肉桂酸、桂皮醛為桂枝主要有效成分，具有降血糖、抗炎等作用，但水煎液中其含有量低于萬分之一，故未列入考察指標，而肉桂酸含有量相對較高而穩(wěn)定，故將其作為指標成分［20?21］；多糖具有抗腫瘤、降血糖、改善胰島素抵抗等作用［22］，方中黃芪、桂枝、白芍和大棗均含該成分，故將其納入研究。另外，干膏率在一定程度上可反映復(fù)方提取效果。因此，本實驗選擇黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、肉桂酸、總多糖提取率及干膏率作為評價指標。

表7 驗證試驗結(jié)果（n＝3）

圖5 提取工藝設(shè)計空間

3.2 指標權(quán)重確定 中藥復(fù)方是通過多成分來共同發(fā)揮作用，與單一指標相比，多指標綜合評價更能反映其整體性，并且關(guān)鍵在于如何確定各指標權(quán)重。AHP 法是一種將定性與定量相結(jié)合，用于解決多目標問題的分析方法［23］，故本實驗通過該方法結(jié)合黃芪桂枝五物湯配伍規(guī)律來確定各指標權(quán)重系數(shù)，以保證綜合評分的科學性和合理性。

3.3 提取工藝優(yōu)化 QbD 理念是從設(shè)計層面確保產(chǎn)品質(zhì)量，實際生產(chǎn)過程中可根據(jù)原料藥材質(zhì)量波動范圍來調(diào)整工藝參數(shù)，從而提高產(chǎn)品一致性。基于該理念，本實驗首先通過查閱文獻結(jié)合前期研究來獲得黃芪桂枝五物湯提取工藝的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，以魚骨圖、FMEA 確定關(guān)鍵工藝參數(shù)，AHP 法確定各指標權(quán)重，計算綜合評分，再采用Box?Behnken 響應(yīng)面法建立提取工藝的數(shù)學模型，最后根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量要求建立設(shè)計空間。