乙醇分級(jí)沉淀黃芪多糖免疫活性的評(píng)價(jià)

劉雅欣 賈 鵬 王 虹 徐桂紅 林桂濤?

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東濟(jì)南250300； 2.齊魯制藥有限公司， 山東 濟(jì)南250100； 3.齊河縣人民醫(yī)院，山東 德州251100）

黃芪主要含有多糖、皂苷、黃酮類成分［1］，其中多糖是其主要活性物質(zhì)，具有抗感染、抗病毒、抗腫瘤等多種活性［2?5］，能增加T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞增殖分化［6］，具有顯著的增加體液免疫、細(xì)胞免疫的作用［7］，該成分生物活性與其結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。研究表明，黃芪多糖酸水解產(chǎn)生的小分子多糖可增加免疫［8］；李紅法等［9］發(fā)現(xiàn)，乙醇分級(jí)沉淀該成分后不僅分子量有所差異，組成也明顯不同，其中甘露糖、半乳糖、鼠李糖含有量降低，葡萄糖含有量升高，抗氧化作用增強(qiáng)。

目前，黃芪多糖注射液有人用［標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)WS?330（Z?029）?2001］和獸用 ［標(biāo)準(zhǔn)編 號(hào)獸藥 字（2013）220592711］，均作為免疫促進(jìn)劑和調(diào)節(jié)劑，其中人用具有補(bǔ)氣補(bǔ)虛功效，能用于免疫功能低下的腫瘤患者［10］，還可減少放化療后不良反應(yīng)發(fā)生［11］；獸用能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，促進(jìn)抗體形成，在防治畜禽病毒性疾病中已成為用量最大的中藥制劑［12］。黃芪多糖制備方法為黃芪加水煎煮提取，濃縮液加入乙醇至含醇量為50%，收集沉淀，加水溶解后再加入乙醇至含醇量為35%，除去沉淀，上清液干燥，即得，該方法保留了35%～50% 乙醇沉淀的多糖，但也損失了高體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀者，該部位中多糖量可能更多，分子量可能更小，免疫增強(qiáng)作用可能更強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)比較黃芪提取液用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分級(jí)沉淀后黃芪多糖含有量、分子量和、免疫活性，以期為改進(jìn)黃芪多糖注射液制備工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 昆明種雄性小鼠，10 周齡左右，體質(zhì)量15～20 g，購(gòu)自山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）20140007。

1.2 儀器 TDD5M 型高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司）；LDZX?50FBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；EPOCH2T 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio?Tek 公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置InfinityⅡELSD 型檢測(cè)器、LC1260 工作站（美國(guó)Agilent 公司）、Shodex OHpak SB?804 型高效凝膠色譜柱（日本昭和電工株式會(huì)社）；YP601N 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 試劑與藥物 黃芪飲片購(gòu)自安徽盛海堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為豆科植物蒙古黃 芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根。印度墨水（北京索萊寶科技有限公司）；環(huán)磷酰胺（江蘇盛迪醫(yī)藥科技有限公司）；注射用生理鹽水；Sephadex G?100 型葡聚糖凝膠（北京酷來(lái)搏科技有限公司）；多糖對(duì)照品，分子量包括73 800 Da ［批號(hào)GBW（E）05006］、126 000 Da ［批號(hào)GBW（E）05007］、285 000 Da ［批號(hào)GBW（E）05008］、496 000 Da［批號(hào)GBW（E）05009］，均購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，以及670 000 Da（批號(hào)9004?54?0），購(gòu)自美國(guó)Sigma?Aldrich公司。其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 多糖制備及其含有量測(cè)定 稱取飲片500 g，加水提取2 次，第1 次加10 倍量，第2 次加8 倍量，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，3 000 r／min 離心10 min，上清液濃縮至500 mL，加無(wú)水乙醇至含醇量為90%，靜置12 h，濾過(guò)，沉淀加水溶解至500 mL，加無(wú)水乙醇至含醇量為90%，靜置12 h，濾過(guò)，沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮依次洗滌至無(wú)色，沉淀加水溶解，定容至500 mL，加入無(wú)水乙醇至含醇量為10%，置于4 ℃冰箱中靜置12 h，3 000 r／min 離心，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌至無(wú)色，得10%乙醇沉淀的多糖（灰白色），上清液繼續(xù)加無(wú)水乙醇至含醇量為35%，置于4 ℃冰箱中靜置12 h，3 000 r／min 離心，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌至無(wú)色，得35%乙醇沉淀的多糖（灰白色）。同法得到50%、70%、90%乙醇沉淀的多糖，顏色分別為灰白色、棕色、棕色。

將不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的多糖在105 ℃下干燥3 h，再于玻璃干燥器中冷卻30 min，稱定粗多糖質(zhì)量，各精密稱取0.05 g，按照文獻(xiàn)［13］報(bào)道的方法測(cè)定多糖含有量，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可知，70%乙醇沉淀的粗多糖質(zhì)量最大，其次是90%乙醇，但其純度低于35%、50% 乙醇；70% 乙醇沉淀的多糖總量最高，幾乎是其他部位的總和。

表1 粗多糖質(zhì)量及多糖含有量測(cè)定結(jié)果

2.2 多糖分子量測(cè)定

2.2.1 多糖純化 將10 g 已處理的Sephadex G?100 凝膠裝柱（柱直徑2.2 cm），吸取20 mg／mL 多糖溶液5 mL，以1 mL／min速度加入柱中平衡30 min 后開(kāi)始洗脫，以3 mL為1 個(gè)收集單位。各精密吸取0.3 mL 至具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，混勻，測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處吸光度，繪制多糖流出曲線［14］，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的多糖在30 個(gè)單位時(shí)即可完全收集；除了70%乙醇沉淀的以外，其他部位多糖分子量接近，難以分離；70%乙醇沉淀的多糖明顯分為2 個(gè)峰，表明至少有2 種分子量相差較大的多糖存在。

圖1 多糖流出曲線

2.2.2 測(cè)定方法

2.2.2.1 色譜條件 Shodex OHpak SB?804 HQ 色譜柱；流動(dòng)相純水；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；Agilent 1260 Infinity ⅡELSD 檢測(cè)器；噴霧溫 度30 ℃；汽化溫度90 ℃；載氣N2，壓力1.6 MPa。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取73 800、126 000、285 000、496 000、670 000 Da 葡聚糖對(duì)照品各6.00 mg，超純水溶解至2 mL，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.2.3 供試品溶液制備 精密量取“2.2.1” 項(xiàng)下4 個(gè)體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的多糖洗脫液各1 mL，置于5 mL 量瓶中，超純水定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.2.4 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液20 μL，在“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。以不同分子量葡聚糖保留時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），葡聚糖分子量對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝-0.535 2X＋8.560 6（R2＝0.995 3），在73 800～670 000 Da 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 葡聚糖凝膠色譜圖

2.2.2.5 精密度試驗(yàn) 吸取分子量73 800 Da 的對(duì)照品溶液，在“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得保留時(shí)間RSD 為2.38%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 結(jié)果 吸取供試品溶液適量，在“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，除了70%乙醇沉淀的多糖外，其他部位均為以1 個(gè)主要分子量多糖為主的混合物，其他分子量多糖較少；根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算，70%乙醇沉淀的多糖存在3 個(gè)主要成分，分子量分別為485 000、394 000、119 000 Da，而其他 部位分別為543 000 Da（35%乙醇）、496 000 Da（50%乙醇）、168 000 Da（90%乙醇），表明乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，多糖分子量越小。

2.3 黃芪多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響

2.3.1 注射液制備 黃芪多糖加注射用水溶解，配制成0.01 mg／mL（按葡萄糖計(jì)）溶液，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，濾液灌封（2 mL 安瓿），121 ℃下滅菌30 min，即得。

2.3.2 分組及給藥 小鼠按照質(zhì)量均衡和隨機(jī)分配的原則分為8 組，即空白組、未分級(jí)沉淀組、10% 乙醇沉淀組、35%乙醇沉淀組、50%乙醇沉淀組、70%乙醇沉淀組、90%乙醇沉淀組、造模組，每組11 只，除空白組外其余各組小鼠每天腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液（精密稱取環(huán)磷酰胺0.2 g，加入20 mL 生理鹽水溶解，3 000 r／min 離心，上清液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，濾液按每瓶2 mL 的規(guī)格注入安瓿中，封口，121 ℃下滅菌）0.1 mL（40 mg／kg），連續(xù)3 d，再腹腔注射0.5 mL 供試品溶液，而空白組小鼠腹腔注射0.5 mL 生理鹽水，連續(xù)10 d。

2.3.3 指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥1 h 后，將25% 印度墨水按0.1 mL／10 g 劑量注入小鼠尾部靜脈，于給藥1、5 min（t1、t2）后在右內(nèi)眥靜脈取血各20 μL，加到3 mL 0.1%Na2CO3溶液中混合均勻，置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上（每組3 個(gè)復(fù)孔），在570 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定光密度值（OD1、OD2），計(jì)算碳粒廓清指數(shù)K，公式為。再將小鼠頸椎脫臼處死，取出肝臟和脾臟，稱定質(zhì)量，計(jì)算吞噬系數(shù)α、脾指數(shù)，公式分別為脾指數(shù)＝，平均脾指數(shù)＝。通 過(guò)SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用Dunnett?t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黃芪多糖對(duì)小鼠脾指數(shù)、吞噬系數(shù)的影響（， n ＝11）

表2 黃芪多糖對(duì)小鼠脾指數(shù)、吞噬系數(shù)的影響（， n ＝11）

注：與模型組比較，?P ＜0.05；與空白組比較，▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01。

由此可知，與空白組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)、吞噬指數(shù)降低（P＜0.05），表明造模成功；各乙醇沉淀組脾指數(shù)升高（P＜0.01），以70%乙醇最明顯，其次是50%乙醇；50%、70%乙醇沉淀組吞噬系數(shù)升高（P＜0.05），90%乙醇沉淀組降低（P＜0.05）。

圖3 多糖凝膠色譜圖

4 討論與結(jié)論

前期曾采用Sevage 法去除黃芪多糖中蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)去除前其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.68 mg／g（10% 乙醇沉淀）、0.71 mg／g（35%乙醇沉淀）、0.79 mg／g（50%乙醇沉淀）、0.96 mg／g（70%乙醇沉淀）、0.66 mg／g（90%乙醇沉淀），而去除后分別為0.55、0.59、0.61、0.65、0.57 mg／g，可知黃芪多糖中原有蛋白質(zhì)含有量較低，即使將其去除也對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響，故本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行相關(guān)處理。另外，多糖中游離單糖可影響其含有量測(cè)定，故本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌的方法進(jìn)行處理，硫酸?蒽酮法檢測(cè)洗滌液時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖中已無(wú)游離的還原性單糖。

結(jié)果顯示，黃芪多糖主要存在于50%、70%、90%乙醇沉淀的多糖中，以70%乙醇沉淀時(shí)總量最高，而35%以下（包括35%）乙醇沉淀時(shí)較低，可知原制備工藝最高醇沉濃度為50%時(shí)會(huì)損失大部分多糖。另外，70%乙醇沉淀時(shí)有3種分子量相差較大的多糖，而其他體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀時(shí)都顯示僅有1 種；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，黃芪多糖分子量降低（但在10%時(shí)對(duì)黃芪多糖免疫活性的貢獻(xiàn)較小，故未測(cè)定其分子量），其中50%、70%乙醇沉淀時(shí)3 種多糖中含有量較高（保留時(shí)間5.686 0 min 左右）者的分子量相近，均以480 000～500 000 Da 為主。

黃芪多糖分子量越低，免疫活性越強(qiáng)，但90%乙醇沉淀時(shí)其分子量顯著降低，免疫活性也明顯減弱。綜合脾指數(shù)、吞噬系數(shù)可知，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的黃芪多糖均有增強(qiáng)免疫活性的作用，程度依次為70%乙醇＞50%乙醇＞35%乙醇≈10%乙醇＞90%乙醇，推測(cè)可能與該成分分子量主要在480 000～500 000 Da 之間有關(guān)。

由此建議，將黃芪多糖制備工藝改進(jìn)為黃芪提取濃縮液加乙醇至含醇量為70%，靜置12 h 后除去上清液，沉淀加水?dāng)嚢柚寥芙猓右掖贾梁剂繛?5%，靜置后除去沉淀，上清液干燥。