糖腎灌腸方對糖尿病腎病的預防作用

葉 婷 徐利娟 藏 登 李 靜 馬 麗?

（1.新疆醫科大學第四附屬醫院內分泌科， 新疆 烏魯木齊830061； 2.新疆醫科大學第四臨床醫學院，新疆 烏魯木齊830000）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常見的微血管并發癥之一［1］，也是導致慢性腎功能衰竭的主要原因之一，并且已經成為終末期腎病的首要原因［2］，其發病機制復雜，近年來研究發現炎癥是病情發生發展的主要因素。不同于傳統的以紅、腫、熱、痛為特點的炎癥，糖尿病腎病是一種因糖代謝紊亂而導致的代謝性炎癥［3］，在其發展過程中，在腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）等炎癥細胞因子的作用下上調黏附分子和趨化因子的分泌，從而進一步有利于白細胞滲入到腎小球局部，導致腎小球系膜細胞的增生和基質分泌增多，促進病情發生與進展。近年來，中藥預防糖尿病腎病的發生發展受到了廣泛關注，糖腎灌腸方作為我院協定處方，具有改善患者營養狀況、減少尿蛋白、改善腎功能、延緩糖尿病腎病的發展的作用［4?6］，但是否具有預防作用尚未深入考察，故本研究觀察該方相關作用，并探尋其作用機制。

1 材料

1.1 動物 昆明種小鼠42 只，SPF 級，體質量（20±2）g，由新疆維吾爾自治區疾控中心實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（新）2016?0003，分籠飼養，每籠5 只，相對濕度40%～70%，溫度20～26 ℃，自由光線，自由攝食攝水，適應性飼養1 周。

1.2 藥物 糖腎灌腸方由生大黃30 g、煅牡蠣50 g、澤瀉30 g、丹參15 g、槐花30 g、黑順片15 g、黃芩30 g 組成，由新疆醫科大學第四附屬醫院藥劑科提供，藥理研究室制作浸膏，方法為15 kg 藥材加12 倍量水煎煮2 次，每次1.5 h，提取液過濾減壓濃縮成稠膏，再減壓干燥，得3.975 kg 干浸膏，得率為26.5%，每22 g 浸膏溶于8.33 mL蒸餾水中。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素（STZ）（北京索萊寶科技有限公司，批號614J031）；考馬斯亮藍貯備液（南京建成生物工程研究所）；拜安捷2 代血糖測定儀（上海健臻醫療科技有限責任公司）；TNF?α 試劑盒（伊萊瑞特公司，貨號E?EL?M0049c）。

1.4 儀器 電子天平（德國Sartoriu 公司）；酶標儀（型號MULTISKAN，美國Thermo 公司）.

2 方法

2.1 造模 小鼠適應性飼養1 周后，隨機選取10 只為正常組，予普通飼料喂養；按照既往造模方法［7?8］，其余32只隨機分為模型組、干預組，給予高糖高脂飼料（2.5%膽固醇、10%熟豬油、1%膽鹽、20%蔗糖、66.5%基礎飼料）喂養，飲用水為高壓滅菌水。每3 d 更換1 次墊料，高糖高脂喂養4 周后造模組小鼠禁食不禁水12 h，給予STZ 溶液（60 mg／kg）腹腔注射，3 d 后予STZ 溶液（90 mg／kg）腹腔注射；正常組予等體積檸檬酸緩沖液腹腔注射。給藥4 d 后小鼠斷尾取血，血糖值≥11.1 mmol／L 判定為糖尿病造模成功；此時干預組給予糖腎灌腸方灌腸，繼續高糖高脂飼料喂養6 周。給藥結束次日，處死干預組小鼠，收集尿液，以尿微量白蛋白＞30 mg／L 判斷為糖尿病腎病造模成功。

2.2 分組與給藥 干預組小鼠于糖尿病模型造模成功后予糖腎灌腸方灌腸，前一晚20 點左右撤食不撤水，灌腸前將小鼠放在鼠籠柵欄蓋上，讓前爪抓住柵欄，輕提尾部使后爪懸空，有輕微前傾趨勢，使肛門充分暴露；從腹部向肛門部用另一只手輕輕地擠壓以協助排便。排便后，在小鼠肛門呈舒張狀態時將灌腸器頭部涂上潤滑劑，并緩慢、輕柔地送入肛門，直達結腸部位。給予高糖高脂飼料喂養，給藥6 周，每天1 次，劑量依據成人給藥量折算后以0.07 mL／10 g 灌腸［9］，糖腎灌腸方藥物總量為200 g，成人體質量按60 kg 計算，則成人給藥劑量為200 g／60 kg，人與小鼠折算劑量為9.1，故小鼠給藥劑量為30 g／kg，以2倍藥量給藥，相當于生藥量0.6 g／10 g，每22 g 浸膏溶于8.33 mL 蒸餾水中，以0.07 mL／10 g 劑量灌腸。

2.3 小鼠腎臟指數測定 麻醉前各組稱取小鼠體質量，麻醉后放血處死，立即剖腹游離出腎臟，濾紙吸干血跡后用電子天平稱腎濕質量，計算腎臟指數（腎濕質量／體質量）。

2.4 尿蛋白測定 給藥結束后收集各組小鼠尿液，考馬斯亮藍法檢測尿蛋白。

2.5 血肌酐測定 給藥結束后取血，Hitachi 7170A 型自動生化分析儀測定各組血清樣品中肌酐水平。

2.6 腎臟組織HE 染色 給藥結束后麻醉放血處死小鼠，立即剖腹游離出腎臟，冰鹽水灌洗后分離腎皮質，常規脫水，石蠟包埋，切片，然后脫蠟，HE 染色，脫水，透明，封片。

2.7 腎臟組織超微結構觀察 給藥結束后麻醉放血處死小鼠后，立即剖腹游離出腎臟，以冰鹽水灌洗腎臟后分離腎皮質，戊二醛固定，制作電鏡切片，進行超微結構觀察。

2.8 血清TNF?α 測定 使用小鼠TNF?α ELISA 試劑盒檢測血清TNF?α 水平，嚴格按照說明書步驟操作。

2.9 統計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行分析，數據以（）表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊時采用LSD 法進行組間多重比較，方差不齊時采用Dunnett’s T3 法進行組間多重比較，檢驗水準α＝0.05，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況 在造模過程中，正常組小鼠毛色光亮，無脫毛，活動自如；造模組小鼠明顯瘦小，毛較粗糙，色澤黯淡，出現精神萎靡，活動遲緩、消瘦、多飲、多尿等癥狀；實驗過程中因造模時間過長、小鼠血糖過高，導致模型組死亡7 只，干預組死亡8 只。

3.2 各組小鼠腎臟指數 與正常組相比，模型組腎臟指數升高（P＜0.01）；與模型組相比，干預組腎臟指數降低（P＜0.01），見表1。

表1 各組腎臟指數比較（）

表1 各組腎臟指數比較（）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

3.3 各組小鼠尿蛋白水平 模型組尿蛋白水平較正常組升高（P＜0.01），干預組尿蛋白水平較模型組降低（P＜0.01）；干預組與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠尿蛋白水平比較（）

表2 各組小鼠尿蛋白水平比較（）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

3.4 各組小鼠血肌酐水平 模型組較正常組血肌酐水平升高（P＜0.01），干預組血肌酐水平較模型組降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組血肌酐水平比較（）

表3 各組血肌酐水平比較（）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

3.5 各組小鼠腎臟HE 染色 正常組小鼠腎小球毛細血管袢開放良好，腎小球毛細血管壁薄而纖細，血管袢外被足細胞，腎小囊壁完整，纖細；模型組小鼠腎小球體積增大，腎小球細胞增多，毛細血管袢開放尚可，管壁僵硬，足細胞減少，腎小囊壁完整；干預組小鼠腎小球毛細血管袢開放尚可，細胞增多，部分足細胞減少，腎小囊壁完整。見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟HE 染色（×400）

3.6 各組小鼠腎臟超微結構 正常組小鼠內皮細胞未見腫脹，系膜細胞未見明顯增生，周圍的系膜基質無擴大，足突細胞未見異常，僅見少量足突融合；模型組小鼠系膜細胞核畸形，系膜細胞增生，足細胞核外形不規則，血管腔閉塞，系膜基質不規則，系膜內可見中等電子密度沉積物，基底膜增厚、皺縮，毛細血管皺縮；干預組小鼠內皮細胞輕微腫脹，系膜細胞未見明顯增生，系膜基質輕度增生，可見少量足突融合。見圖2。

圖2 各組小鼠腎臟超微結構（×8 000）

3.7 各組小鼠血清TNF?α 水平 與正常組相比，模型組及干預組小鼠TNF?α 升高（P＜0.01）；與模型組相比，干預組TNF?α 下降（P＜0.01），見表4。

表4 各組小鼠TNF?α 水平比較（）

表4 各組小鼠TNF?α 水平比較（）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

4 討論

DKD 是糖尿病主要微血管并發癥之一，是慢性高血糖所致的腎臟損害，病變累及全腎。在我國，DKD 是終末期腎病的主要原因［10］。DKD 屬于中醫“消渴病腎病” 范疇，中醫認為其發病機理為消渴病日久，耗氣傷陰，病情遷延，陰損及陽，漸致痰、郁、濕、熱等病理產物瘀阻血脈，津血交換受阻，廢物積聚日久成毒，毒（糖毒、脂毒）隨邪生入絡，伏藏不去［11］。針對消渴病腎病發生的病機，以“生大黃、煅牡蠣、澤瀉、黃芩” 等藥物組方的糖腎灌腸方具有“調理脾腎、益氣活血、扶正祛邪、泄濁解毒” 之功，作為我科協定處方長期應用于臨床，療效顯著。

尿蛋白及血肌酐升高是DKD 的臨床特點之一，在本研究中，干預組小鼠在疾病發展過程經糖腎灌腸方預防性治療后尿蛋白及血肌酐水平低于模型組，腎臟指數較模型組減小；光鏡下，模型組腎小球體積增大，腎小球細胞增多，管壁僵硬，足細胞減少；腎臟超微結構中模型組系膜細胞核畸形，系膜細胞增生，足細胞核外形不規則，血管腔閉塞，系膜基質不規則，系膜內可見電子密度沉積物，基底膜增厚、皺縮，毛細血管皺縮，表明DKD 造模成功；干預組病理結構改變較模型組輕微。由此可以證明：在糖尿病發生后，予糖腎灌腸方保留灌腸干預，可以延緩腎臟病理改變。

近來研究認為，固有免疫介導的慢性、低水平炎性反應在DKD 發生、發展中起核心作用［12?13］。因此，微炎癥狀態的改善是臨床癥狀及病理結構改善的基礎。TNF?α 主要由活化的單核／巨噬細胞產生，作為體內重要的炎性反應介質，參與早期DKD 腎血流動力學異常改變，不但能刺激腎小球系膜細胞收縮、增生、分泌炎性介質，也能刺激膠原和成纖維細胞產生，最終通過損傷內皮細胞激活內源性凝血和炎癥機制［14］。TNF?α 過度釋放會促進巨噬細胞浸潤，導致腎小球基底膜增厚，加速腎小球硬化，此外，TNF?α還會使血管內皮舒張，引起腎小球血管收縮，從而導致腎血流動力學發生改變，致使腎小球濾過率降低［15］。本研究中模型組TNF?α 較正常組升高，與既往研究結論相符；干預組小鼠給予糖腎灌腸方預防性治療6 周后，血清TNF?α水平較模型組低，提示糖腎灌腸方能夠抑制糖尿病小鼠血清TNF?α 升高；

糖腎灌腸方中主藥大黃，具有攻積導滯、瀉火解毒、涼血化瘀、泄濁利尿等功效，現代藥理學研究表明大黃對巨噬細胞的免疫活性具有雙向調節作用，并且對TNF?α 及某些白細胞介素類的細胞因子具有一定的抑制作用［16?17］。劉超等研究結果表明：應用大黃的主要提取物大黃素后，實驗小鼠外周血中的TNF?α 表達及脾細胞中TNF?α mRNA的表達均降低［18］，提示大黃具有抑制炎癥反應的作用。佐以質重之牡礪，以斂陰潛陽，收斂固澀，化痰軟堅；澤瀉，氣平，味甘而淡，最善滲泄水道，專能通行小便，研究表明，以澤瀉為君藥的澤瀉湯治療高脂血癥大鼠后，大鼠腹腔巨噬細胞分泌的TNF?α 和IL?6 明顯減少，說明其能夠改善大鼠炎癥狀態［19］。黃芩，味苦，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功，已有大量研究證明黃芩能夠通過抑制多種炎癥因子改善炎癥狀態，其中TNF?α 即為其重要的靶向分子之一［20］。諸藥合用，契合消渴病腎病的病機；同時采用保留灌腸的方法給藥是糖腎灌腸方的主要治療優勢。

人體75%的尿素氮通過腎臟代謝，25% 經腸道排泄，因此，當腎功能受損后，腸道成為尿素氮的主要代謝途徑，中藥灌腸療法是在張仲景蜜煎導法基礎上不斷發展和完善起來的中醫外治法；中藥保留灌腸使部分藥液在結腸內吸收，部分直接發揮作用，促使毒素從腸道排出，從而降低血肌酐、尿素氮的水平；另一方面，DKD 患者因多年的糖尿病，其胃腸功能均有不同程度損害，胃腸道癥狀突出，加之腎功不全毒素蓄積體內，刺激胃腸引發的胃腸中毒癥狀，導致服藥成為困難，因此采用中藥保留灌腸的方法能夠避免因服藥加重胃腸道不適。并且經腸道給藥，藥物通過腸黏膜被吸收，沿中、下直腸靜脈進入下腔靜脈，可避免肝臟的“首過效應”，保證有效血藥濃度，減少了藥物對肝臟的毒副作用，具有全身治療作用。

綜上所述，糖腎灌腸方通過腸道給藥作用于全身，能夠抑制血清TNF?α 水平升高，延緩腎臟病理結構改變，抑制DKD 小鼠尿蛋白及血肌酐水平，對DKD 起到預防作用。