對葉百部總生物堿對辣椒素致豚鼠咳嗽的影響

楊丹丹 許立拔 夏 星 吳思宇 王孝勛? 梁瓊月

（1.廣西中醫藥大學， 廣西 南寧530200； 2.廣西中醫藥大學壯瑤藥重點實驗室， 廣西 南寧530200）

咳嗽是臨床上很多疾病的癥狀，可由外源性或內源性刺激物刺激呼吸道黏膜，造成許多神經肽的釋放，神經肽刺激感受器引起神經沖動，刺激咳嗽中樞，大腦皮質控制性失衡而產生咳嗽［1］。咳嗽是機體一種重要的防御反射，可清除呼吸道異物，但頻繁劇烈或長時間的咳嗽會給患者工作、生活帶來嚴重影響。《濟世方·咳嗽》：“五臟六腑皆令人咳，非獨肺也”，中醫認為咳嗽 “必自肺而穿五臟”，五臟六腑功能失調，導致邪客于肺，均可引發咳嗽，故其病因很復雜［2］。

對葉百部為百部科植物對葉百部Stemona tuberosaLour.的干燥塊根，有潤肺下氣止咳、殺蟲滅虱之功效。課題組前期研究表明，廣西不同產地對葉百部總生物堿對小鼠均有止咳作用，但具體機制尚不明確［3］。本實驗考察對葉百部總生物堿對辣椒素致豚鼠咳嗽的影響，以期為相關新藥開發和臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 Dunkin Hartley 種白化豚鼠（DH 豚鼠），普通級，雌雄各半，雌性體質量251.1～323.8 g，雄性體質量293.8～392.4 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，生產許可證號SCXK（湘）2014?0010，動物室符合普通級要求。

1.2 試劑與藥物 對葉百部總生物堿由廣西中醫藥大學壯瑤藥重點實驗室提供，酸性染料比色法測得其質量分數為82.15%。磷酸可待因（青海制藥廠有限公司，批號20160915）；辣椒素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號G1502115）；羧甲基纖維素鈉（CMC?Na，國藥集團化學試劑有限公司，批號20160704）；磷酸鹽緩沖液（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號20171012）；水合氯醛（成都市科隆化學品有限公司，批號2017091901）；4% 多聚甲醛（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號201803）；豚鼠P 物質（SP）酶聯免疫檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180627）。

1.3 儀器 KQ?500DA 型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5810R 型冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；RCT B 型磁力攪拌器（德國IKA 公司）；BSA224S 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；SIM?F140AY65?PC 型制冰機（日本大阪松下電器產業株式會社）；FJ?200 型分散均質機（上海標本模型廠）；WH?2000型超聲波霧化器（廣東粵華醫療器械廠有限公司）；Infinite M200pro 型酶標儀（瑞士Tecan 公司）。

2 方法

2.1 對葉百部總生物堿制備 稱取對葉百部粉末（過二號篩）1 kg，置于具塞錐形瓶中，精密加入10 L 甲醇超聲40 min，放冷，搖勻，濾過，取濾液，旋轉蒸發儀揮干溶劑，殘渣加2 500 mL 4% 鹽酸溶解，抽濾，濾去酸不溶性成分，濾液加氨水調至pH 9～10，析出沉淀，將沉淀與溶液一起移至分液漏斗，加4 L 氯仿萃取，取下層氯仿層清液，揮干溶劑，即得對葉百部總生物堿。取140 mg，研磨成細粉后加0.5% CMC?Na 至10 mL，充分混勻成混懸液，即得高劑量藥液（14.0 mg／mL），同法配制低、中劑量藥液（3.5、7.0 mg／mL），臨用現配，給藥時用磁力攪拌器充分混勻。

2.2 分組、造模與給藥 60 只豚鼠隨機分為正常組，模型組，對葉百部總生物堿低、中、高劑量組（5、10、20 mg／kg），磷酸可待因片組（10 mg／kg）［4］，每組10 只，按1.4 mL／kg 劑量灌胃給藥，每天1 次，連續3 d，正常組、模型組給予等體積0.5%CMC?Na 溶液。記錄給藥前及給藥結束豚鼠體質量，并計算其增長值。

2.3 咳嗽指標 豚鼠禁食不禁水12～14 h，末次給藥后1 h先將超聲波霧化器連接5 L（直徑20 cm，高16 cm）帶硅膠蓋的密閉透明三角玻璃燒瓶罩中，開動霧化器調節到0.5 mL／min，使玻璃罩內充滿霧化0.03 mol／L 辣椒素，除正常組不做任何處理外，其余各組豚鼠放入玻璃罩內，每個罩子1 只，繼續噴霧120 s，記錄10 min 內豚鼠咳嗽次數（咳嗽聲響亮時進行）［5］，計算鎮咳率，公式為鎮咳率＝［（模型組咳嗽次數-給藥組咳嗽次數）／模型組咳嗽次數］×100%。

2.4 采血與取材 檢測咳嗽指標后，所有豚鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL／kg）麻醉，腹主動脈采血，4 ℃、3 000 r／min 下離心20 min，分離血清，分裝凍存。采血后分離氣管，肺左下葉置于4% 多聚甲醛中固定，HE 染色，用于組織病理學檢測；同一部位分離肺右下葉組織100 mg，按1 ∶5 比例加入PBS 緩沖液（pH ＝7.4），迅速勻漿，4 ℃、3 000 r／min 下離心20 min，分離上清液，分裝凍存［6］。ELISA 法檢測血清及肺組織SP 水平，具體操作按試劑盒說明書進行；酶標儀在450 nm 波長處檢測吸光度（OD），擬合標準曲線，計算結果。

2.5 統計學分析 通過SPSS21.0 軟件進行處理，計量數據以（ˉ）表示，若符合正態分布和方差齊性，多組間比較采用單因素方差檢驗，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；若不符合正態分布或方差齊性，多組間比較采用秩和檢驗，組間兩兩比較采用Mann?Whitney U 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 對葉百部總生物堿對豚鼠體質量的影響 表1 顯示，給藥3 d 后與正常組比較，模型組豚鼠體質量及其增長程度均無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠體質量及其增長程度均無明顯差異（P＞0.05）。

表1 對葉百部總生物堿對豚鼠體質量的影響（， n＝10）

表1 對葉百部總生物堿對豚鼠體質量的影響（， n＝10）

3.2 對葉百部總生物堿對咳嗽指標的影響 表2 顯示，與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠咳嗽次數均減少（P＜0.01），高劑量組咳嗽潛伏期延長（P＜0.05），并且鎮咳率與劑量呈正比。

表2 對葉百部總生物堿對咳嗽指標的影響（， n＝10）

表2 對葉百部總生物堿對咳嗽指標的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.3 對葉百部總生物堿對豚鼠血清和肺組織SP 水平的影響 表3 顯示，與正常組比較，模型組豚鼠血清和肺組織SP 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠血清和肺組織SP 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3.4 對葉百部總生物堿對豚鼠氣管組織病理改變的影響圖1 顯示，正常組豚鼠氣管黏膜光滑，含有杯狀細胞和纖毛細胞的假復層纖毛柱狀上皮，未見增厚或水腫，管腔光滑；模型組豚鼠氣管黏膜上皮明顯增厚，表面粗糙，有腫脹突起；與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠氣管黏膜增厚明顯改善，表面較光滑，腫脹明顯消除。

3.5 對豚鼠肺組織病理改變的影響 圖2 顯示，正常組豚鼠肺泡壁薄，排列整齊，邊界清晰；模型組豚鼠出現肺實變，肺泡明顯萎陷，肺泡擠壓，邊界不清晰；與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠肺實變明顯改善，肺泡萎陷明顯改善，邊界較清晰，擠壓程度明顯減輕。

表3 對葉百部總生物堿對豚鼠血清和肺組織SP 水平的影響（， n＝10）

表3 對葉百部總生物堿對豚鼠血清和肺組織SP 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

圖1 各組豚鼠氣管組織病理改變（HE，×400）

圖2 各組豚鼠肺組織病理改變（HE，×400）

4 討論

咳嗽病名最開始記載于《黃帝內經》，是一種常見的臨床癥狀。中醫認為，咳嗽是因肺失清輕或肅降致肺氣上逆所致，《靈樞經.九針論》 曰：“五臟氣，肺主咳”，咳嗽病因復雜，五臟的病變皆可引起咳嗽。百部用于咳嗽治療，始載于陶景洪的《名醫別錄》：“白并，味苦無毒。主治肺咳上氣，行五臟，令百病不起”。白并即為百部，常用于咳嗽、外感、內傷、暴咳、久嗽等的治療，為治療肺癆之要藥，對急慢性及各種原因產生的咳嗽，均可治療，能行五臟，令百病不起，應該是百部可用于治療各種原因引起咳嗽的主要作用機制。現代研究表明，對葉百部有抗肺炎支原體［7］、抗氧化［8］、中樞鎮靜、鎮痛、止咳化痰［9］、抗菌、殺蟲［10］等，可能是對葉百部止咳的相關機制，而對葉百部總生物堿是其發揮藥效作用的主要成分［3］。

辣椒素是一種咳嗽刺激劑，主要通過刺激C 纖維受體來引咳。辣椒素刺激氣管黏膜疼痛、微循環增加及支氣管痙攣，導致局部血漿滲出、血管擴張及水腫，激發Ca2＋為主的陽離子內流，促進SP 和炎癥趨化因子釋放，引發肺和氣管神經源性炎癥反應［11］。辣椒素致神經源性炎癥的主要神經遞質是SP，SP 是具有多種生物活性的11 肽，可直接刺激感覺神經末梢介導神經源性炎癥，引起支氣管平滑肌收縮、血漿滲出、黏液分泌增加、炎癥介質釋放增加、血管通透性增加及氣道上皮損傷或脫落［12?13］。本實驗結果表明，辣椒素可引起豚鼠明顯咳嗽次數增多，血清和肺組織SP 水平顯著升高，氣管黏膜上皮明顯增厚，表面粗糙及水腫，肺實化，肺泡明顯萎陷，表明辣椒素復制的豚鼠咳嗽模型成功。

對葉百部總生物堿可顯著減少辣椒素所致豚鼠咳嗽次數及延長咳嗽潛伏期，顯著降低血清和肺組織SP 水平，明顯減輕氣管上皮和肺泡的損傷，這可能與對葉百部總生物堿可行五臟，減少SP 的產生和體內的蓄積，減輕炎癥反應有關，其鎮咳作用也可能與其中樞性鎮咳作用有關［9］。對葉百部總生物堿有明顯的拮抗辣椒素致的咳嗽作用，其機制可能與減輕辣椒素對呼吸系統的損傷和抑制神經肽SP 產生及表達有關。