Neuritin與HSP60表達水平與肝細胞凋亡調節的相關性

武文博 朱美意 歐陽軍 (石河子大學醫學院第一附屬醫院急診外科，新疆 石河子 832000)

肝臟是體內以代謝功能和再生能力為主的最大內臟器官，然而在生理狀態下，絕大部分肝細胞正處于穩態，在受到外傷、感染、中毒、部分肝切除等損害因素造成肝臟受損后，存留的肝細胞會快速增生修繕受損部位，進而程序性表達極強的再生能力〔1～4〕。同時，肝臟的增殖重建涵蓋復雜的病理生理全過程，牽涉到很多種細胞內外影響增殖及凋亡蛋白的調節。但是，肝損害后增殖修復的明確分子機制仍未全然認清。

1993年美國麻省理工學院的以色列籍科學家Nedivi及其同事發現Neuritin〔5〕是一種活性誘導的神經營養因子，曾經普遍視為其高度自限在神經細胞。2005年日本學者Nobuhiko研究發現Neuritin蛋白的表達水平隨著肝臟的發育成熟而逐漸增高，成年小鼠的Neuritin蛋白表達量最多。同時，將成年小鼠的肝臟部分切除后Neuritin蛋白的表達水平呈現一過性降低，術后24 h伴隨肝臟再生的開始，Neuritin蛋白的表達量隨之升高，其升高水平與細胞周期蛋白(cyclin)D1(cyclinD1是肝臟成熟和再生的指標)一致〔6〕。據此可知Neuritin蛋白具備促使肝臟再生修復的功能。

課題組通過酵母雙雜交技術及生物信息學技術發現了 Neuritin 與多條細胞增殖的基因有相互作用，熱休克蛋白(HSP)60包含其中。HSP60是HSP家族的核心成員，最核心的功能是分子伴侶〔7〕，參與細胞周期與凋亡的調控〔6，8，9〕。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3是Caspase家族中最重要的成員，現在被認為是細胞調亡過程中最重要的終末剪切酶，細胞凋亡絕大部分都要依賴Caspase-3誘導的信號傳導通道進而引發細胞凋亡〔10〕。但是Neuritin和HSP60在肝細胞內對Caspase-3的調控通路仍未確切。本研究通過體外細胞實驗探討Neuritin與HSP60在肝細胞中的表達水平及對細胞凋亡調節的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 BRL大鼠肝細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；Neuritin抗體、HSP60抗體、Caspase-3抗體(Abcom 公司)；Neuritin蛋白(Sino Biological公司)；HSP60蛋白(Abcom 公司)；Marker(Thermo Scientific公司)，β-actin抗體(中杉金橋公司)；NC膜(Whatman公司)；DMEM液體培養基(Heclone 公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金橋公司)；與一抗對應的免疫熒光二抗(Bioss公司)；Western印跡、免疫熒光所需各種儀器設備。

1.2方法

1.2.1細胞培養 (1)將BRL大鼠肝細胞放于含有10%胎牛血清的DMEM培養基貼壁繁殖；待細胞貼壁率達95%～100%，吸出舊培養基，0.25%胰蛋白酶消化傳代，再次加入1 ml DMEM培養基中止消化，800 r/min離心5 min，吸走上清液。(2)將含有10%胎牛血清的DMEM培養基重懸后緩緩吹打肝細胞，待其分散成單個肝細胞，將細胞懸液按照1∶3的比例接種至新的培養皿中，飽和濕度、37℃、5%CO2、95%空氣恒溫培養箱正常培養，間隔8 h進行換液。

1.2.2干預 (1)待培養皿中細胞生長狀態較好，長至60%，準備好干預。(2)將上述培養皿，隨機分為4大組，分別為Neuritin低表達組、Neuritin高表達組、HSP60低表達組、HSP60高表達組。每個大組分為5個小組，對照組(n=4)和實驗組(n=16)，對照組不做任何處理，Neuritin低表達組實驗組分別給予0.1 、0.3、0.5、0.7 μg/ml的Neuritin抗體；Neuritin高表達組實驗組分別給予0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的Neuritin蛋白；HSP60低表達組實驗組分別給予0.6、0.8、1.0、1.2 μg/ml的HSP60抗體；HSP60高表達組實驗組分別給予10、50、100、200 ng/ml的HSP60蛋白，BRL肝細胞培養48 h后使用Western印跡檢驗Neuritin、HSP60及Caspase-3在肝細胞中的表達量。

1.2.3Western印跡法 BRL肝細胞培養48 h后分別提取上述各組細胞蛋白，5×十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解緩沖液裂解細胞，測各組蛋白濃度，調平每組蛋白提取液濃度時采用細胞降解液，獲取肝細胞總蛋白，100℃煮沸8 min，12 000 r/min離心5 min，獲取上清液。15 μl目的蛋白經15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出來后采用電轉移至NC膜上，使用5%脫脂奶粉TBST封閉2 h，分別加一抗(Neuritin抗體1∶500、HSP60抗體1∶20 000、Caspase-3抗體1∶300、β-actin 抗體 1∶1 000)，4℃ 過夜。TBST溶液洗膜4次(1次5 min、3次15 min)，對應的二抗〔辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)1∶2 500，辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)1∶2 500〕。用ECL發光試劑盒顯影檢測蛋白印跡條帶，Quantity one 分析蛋白條帶灰度值。運用目地蛋白條帶灰度值和相應的β-actin灰度值之比視為蛋白相對表達量。

1.2.4細胞免疫熒光 將六孔板中生長狀態優良的肝細胞使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次2～3 min，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，每次2 min，0.2%TritonX-100透化3 min，PBS清洗，5%牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉30 min，倒去封閉液，同時加一抗(Neuritin抗體1∶100、HSP60抗體1∶100)置于濕盒4℃過夜，第二天復溫后PBS清洗，在暗室加PBS稀釋后的熒光二抗(1∶50)37℃、2 h，PBS沖洗3次，滴加抗熒光淬滅劑封片，最后使用共聚焦顯微鏡觀察。

1.3統計學處理 采用Graphpad8.0軟件進行方差分析、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1Neuritin低表達在肝細胞中對HSP60及Caspase-3變化的影響 與對照組相比，0.1、0.3、0.5、0.7 μg/ml的Neuritin抗體組Neuritin相對表達水平逐漸降低，Caspase-3相對表達量逐漸增高(均P<0.05)；各組HSP60相對表達水平基本一致，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1，圖1。

表1 Neuritin低表達在肝細胞中對HSP60及Caspase-3變化的影響

1～5：對照組、0.1、0.3、0.5、0.7 μg/ml的Neuritin抗體組

2.2Neuritin高表達在肝細胞中對HSP60及Caspase-3變化的影響 與對照組相比，0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的Neuritin蛋白組Neuritin相對表達水平逐漸升高，Caspase-3相對表達程度逐漸減低，差異均有統計學意義(均P<0.05)；HSP60相對表達水平基本一致，差異沒有統計學意義(P>0.05)；見表2，圖2。

表2 Neuritin高表達在肝細胞中對HSP60及Caspase-3變化的影響

1～5：對照組、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的Neuritin蛋白組

2.3HSP60低表達在肝細胞中對 Neuritin及Caspase-3變化的影響 與對照組相比，0.6、0.8、1.0、1.2 μg/ml的的HSP60抗體組HSP60相對表達水平逐漸降低，Caspase-3相對表達量逐漸增高，差異均有統計學意義(均P<0.05)；各組Neuritin相對表達程度基本相同，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3，圖3。

表3 HSP60低表達在肝細胞中對HSP60及Caspase-3變化的影響

1～5：對照組、0.6、0.8、1.0、1.2 μg/ml的HSP60抗體組

2.4HSP60高表達在肝細胞中對Neuritin及Caspase-3變化的影響 與對照組相比，10×10-3、50×10-3、100×10-3、200×10-3μg/ml的Hsp60蛋白組HSP60相對表達水平逐漸增高，Caspase-3相對表達水平漸漸減低，差異均有統計學意義(均P<0.05)；各組Neuritin相對表達程度基本相同，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4，圖4。

表4 HSP60高表達在肝細胞中對HSP60及Caspase-3變化的影響

1～5：對照組、10×10-3、50×10-3、100×10-3、200×10-3 μg/ml的HSP60蛋白組

2.5Neuritin、HSP60在肝細胞內和Caspase-3的相關性分析 Neuritin低表達組和Neuritin過表達組中，Neuritin表達與Caspase-3表達呈明顯負相關(r=-0.993，P<0.05)(圖5)；HSP60低表達組和HSP60高表達組中，HSP60表達與Caspase-3表達呈明顯負相關(r=-0.996，P<0.05)(圖6)。

圖5 Neuritin和Caspase-3的相關分析

圖6 HSP60和Caspase-3的相關性

3 討 論

引發細胞凋亡程序的因素主要是通過Caspase-3介導的細胞信號傳導途徑而導致細胞凋亡。在細胞增殖和凋亡程序中起著關鍵作用是線粒體通道，然而在凋亡調控基因中，最受矚目的是Bcl-2 家族、Caspase家族，其中抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白和促凋亡蛋白Bax蛋白是目前為止在凋亡調節進程中基本功能彼此對立的一對不可或缺的調節蛋白〔11〕。Caspase-3的活性和細胞凋亡呈正相關，主要通過細胞色素(Cyt)C的釋放進而影響線粒體通道誘導的Caspase凋亡。當細胞接收到來自凋亡的信號，如外源性信號(大部分肝切除、電離輻射、化療藥物等)，或內源性因素〔Neuritin、HSP60、活性氧(ROS)生成等〕，引發Bax和Bcl-2激活，導致線粒體膜兩側化學濃度差消失，跨線粒體膜兩側電位梯度消失，線粒體基質中儲存的Ca2+釋放導致線粒體膜通透性增高并大量釋放CytC〔12～15〕。CytC釋放入細胞質后與Caspase結合形成復合物，進而使信號傳遞至下游Caspase-3，最后使細胞凋亡信號持續傳送下去〔16,17〕。

研究表明Neuritin、HSP60參與細胞增殖及凋亡的調控〔18〕。人類Neuritin基因〔候選可塑性基因(CPG)15〕位于6號染色體上(6p25.1)；長2 072 bp；并且在物種間高度保守，人與鼠之間的同源性高達97%(cpg15)。其在神經元可塑性和再生中發揮重要作用，同時還涉及抗細胞凋亡、血管生成、腫瘤發生等生物過程。研究發現胚胎腦中表達的可溶性Neuritin可以通過阻止Caspase-3介導的細胞凋亡途徑，來抑制皮質祖細胞的凋亡，進而調節其存活〔19〕。有文獻報道Neuritin在施萬細胞中同樣也有表達〔20〕。在過量表達Neuritin的施萬細胞中克隆Bcl-2的功能，導致Caspase-3活性增加，從而增加細胞凋亡。這顯示了該途徑中Neuritin與Bcl-2的關系。隨著細胞凋亡的變化，Caspase-3和Caspase-9的活性發生了相應的變化。同樣的，研究發現〔21〕通過磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)上調Neuritin表達，類胰島素1號增長因子(IGF1)可以施萬施萬細胞的凋亡，Neuritin是該途徑的下游元素，研究表明，在體外高血糖癥狀下，Neuritin是IGF1對施萬細胞凋亡的調節劑或介質，至少通過抗凋亡元件Bcl-2。研究發現外源性IGF1在一定程度上阻止了施萬細胞暴露于高血糖的細胞凋亡。在給定的高血糖水平下，Neuritin介導IGF1的作用，IGF1的作用隨劑量而變化。研究表明IGF1可能是抗細胞凋亡途徑的上游調節因子：PI3K-Neuritin-Bcl-2-Caspase-3〔21〕。有趣的是，本實驗通過使Neuritin低表達及高表達研究發現，Neuritin和Caspase-3呈現出相反的變化趨勢，并且影響Neuritin的表達水平，并不能影響HSP60的表達。結合上述研究筆者歸納其機制可能為Neuritin激活Bcl-2抗細胞凋亡作用，從而影響Caspase-3的表達，最后起到抗細胞凋亡的作用。

以往研究證實HSP60是重要的線粒體分子伴侶，然而如今研究發現HSP60同時存在于細胞膜、細胞質〔10〕。目前研究表明 HSP60 的主要功能如下：①參與新生蛋白質的正確折疊和組裝及變性蛋白質的恢復過程；②在細胞周期與細胞凋亡中起到調控作用；③參與蛋白質跨膜轉移；④具有抗氧化功能；⑤在免疫中起作用〔6,9,10〕。HSP60作為分子伴侶的確切作用機制尚不明確，因為據報道它可以促凋亡或抗細胞凋亡〔22〕。Gupta等〔23〕研究發現在心臟細胞質中HSP60與Bax，Bak和Bcl-XL復合，但不與Bcl-2復合。HSP60表達的減少促進細胞凋亡，但不改變線粒體功能。在缺氧期間HSP60在細胞分布位置發生變化，HSP60離開細胞質，轉移到質膜。總細胞HSP60直到復氧(10 h才改變；然而，CytC從線粒體釋放發生在再氧合之前，與HSP60的重新分布一致。在缺氧期間HSP60、Bax和HSP的變化，CytC可以通過三磷酸腺苷(ATP)消耗來復制。HSP60也被證明可以加速pro-Caspase-3的裂解。因此，HSP60在細胞凋亡程序中起關鍵作用。HSP60在正常條件下與Bax的結合表明其在細胞凋亡中的關鍵調節作用。同樣的Caruso Bavisotto等〔22〕研究報道雙(吡啶基)惡二唑酮絡合物(CubipyOXA)的促細胞凋亡作用可能是使HSP60水平的降低和其阻斷HSP60/pro-Caspase-3復合物的形成，因此阻礙了HSP60的抗細胞凋亡作用。腎上腺皮質癌(ACC)中HSP60激活ERK和Akt，減少Bax和CytC釋放及Caspase-3級聯的凋亡信號傳遞〔24〕。HSP60信號傳導的喪失有助于糖皮質激素誘導的促凋亡反應的增強，從而加速成骨細胞凋亡和骨質量損失〔25〕。本實驗通過在肝細胞體外實驗使HSP60低表達及高表達研究發現，HSP60和Caspase-3表達水平顯現出相反的變化趨勢，并且影響HSP60的表達水平，并不能影響Neuritin的表達。進而推斷HSP60可能通過抑制Bax的促細胞凋亡作用，進而影響Caspase-3的表達，最后呈現出抗細胞凋亡的作用。

由本研究結果可知，HSP60與Neuritin低表達可以促進細胞凋亡，而HSP60與Neuritin過表達抑制細胞凋亡。筆者推測HSP60和Neuritin可能通過某種協同作用共同參與肝細胞的抗凋亡調控機制。