Caspase-9、 XIAP與非小細胞肺癌的相關性

李云飛 劉代順 劉振峰

(1遵義市第一人民醫院呼吸科，貴州 遵義 563000;2遵義醫科大學第三附屬醫院)

凋亡逃逸在惡性腫瘤形成中起關鍵作用，其中XIAP屬于凋亡抑制蛋白(AP)家族中的成員，被認為是家族凋亡抑制作用最強的蛋白之一。XIAP可有效抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)，包括Caspase-9和Caspase-3等，從而起到抑制腫瘤凋亡作用〔1〕。非小細胞肺癌(NSCLC)與XIAP和Caspase-9基因的關聯性報道較少，本文使用免疫組化和轉染技術分析兩種基因在NSCLC中的表達情況，并觀察正常組織中與NSCLC患者組織中兩種基因的表達差異進行分析，研究XIAP和Caspase-9基因與NSCLC發展和發生的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年5月至2014年5月于遵義市第一人民醫院行NSCLC手術切除患者標本56例，其中鱗癌12例、支氣管肺泡癌23例及腺癌21例，上述患者均經病理確證；選取同期24例經手術切除距病灶>5 cm處肺組織者作為對照，組織取出后放入液氮進行冷凍，并放于-80℃冰箱中保存；24例對照患者男15例，女9例，年齡34～73歲，平均年齡(42.3±8.9)歲，上述納入者術前均未行NSCLC相關治療；患者或家屬均已簽署知情同意書。

1.2主要試劑 兔來源XIAP多克隆抗體購于美國thermo 公司(編號：PA126426)；兔來源的多克隆抗體Caspase-9購于美國abcam公司(編號：Ab137392)；羊抗兔IgG抗體-辣根過氧化物酶(HRP)多聚體的二抗購于中國碧云天；免疫組化檢測試劑盒EnVisionTM Two-Step購于丹麥DAKO公司(批號：1701777A)。病毒DNA抽提試劑盒購于Invitrogen公司(批號:1681569A)。

1.3免疫組化 根據免疫組化試劑盒步驟進行組織石蠟切片，二甲苯脫蠟10 min×2次，無水乙醇3 min×2次、95%乙醇2 min×2次、70%和80%乙醇分化2 min，經自然水化后行蒸餾水洗。抗原修復使用pH6.0高溫高壓抗原修復；時間是在冒氣后計時100 s，然后流水沖洗至室溫，蒸餾水洗后行磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次，內源性過氧化物經3%過氧化氫(H2O2)水溶液阻斷10 min后給予PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗，放于37℃下進行孵育60 min。對照使用PBS替代一抗并行PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體二抗，放于37℃下進行孵育40 min，PBS沖洗5 min×3次，經二胺基聯苯胺(DAB)顯色1 min，并放于顯微鏡下觀察反應狀態，使用純凈水沖洗終止反應；Harris蘇木素液對細胞進行復染1 min，并使用100%和95%的乙醇進行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組織化學陽性為黃色或黃棕色，細胞核襯染呈藍色。Caspase-9和XIAP表達情況：兩種基因均存在于腫瘤細胞核內或胞質中，Caspase-9壞死凋亡區陽性降低，而XIAP基因則表現為陽性增加；陽性判斷：上述兩種基因均使用圖像分析系統進行測量，于顯微鏡下選取病死灶周邊區域3～5個染色陽性并拍照記錄，并應用積分光密度(IOD)測量陽性細胞的強弱。將納入的鱗癌、腺癌和支氣管肺泡患者切除的組織和正常組織通過上述試驗方法檢測Caspase-9的表達。

1.4構建慢病毒質粒 傳代293T細胞：每個T75瓶加2 ml明膠，24孔板每個孔加3滴明膠，于37℃培養箱放置15 min以上。

將培養的細胞放入培養基中進行抽吸，吸凈后加入0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)液2 ml，均勻覆蓋瓶底后放于37℃下保溫箱中培養2 min后取出，加入3 ml 37℃水浴中預熱的完全培養基終止，吹打6～8次。將瓶中細胞吸出并放于15 ml離心管中，同時取50 μl細胞液放于EP管中，并加入450 μl培養基進行10倍稀釋。鋪細胞。細胞數量為1 000萬/T75瓶，350萬/T25瓶，24孔板則30萬/孔，最后加新鮮培養液至總體積為10 ml/T75瓶； 4 ml/T25瓶；0.5 ml/24孔板每孔。第2天轉染前觀察細胞密度，若細胞密度匯合>80%則可繼續轉染；預備37℃水將I減血清培養基(Opti-MEM)放入預熱，脂類(Fugene)轉染劑需再正常室溫下才可有效。將預熱后的Opti-MEM加入微量離心管中，并依次加入質粒，吹打5～6次后加入Fugen轉染劑。Fugene轉染試劑需加至Opti-MEM液面之下，立即充分混勻，瞬時離心后室溫放置18 min，即可加入培養瓶中，晃勻后放入培養箱中培養，間隔2～4 h晃勻一次。轉染后12～24 h(次日)，觀察熒光情況并更換培養基；T25和T75瓶中分別裝入4 ml和12 ml；換液時間為48 h后，換液后T25和T75瓶中液分別為3 ml和8 ml；24孔板中每孔為0.5 ml。收集轉染后48 h和72 h病毒，并進行離心5 min取出細胞碎片，放于4℃保溫箱中保存(保存時間不超過1 w)。24孔板滴度使用懸浮轉染進行測定，先用明膠包被24孔板15 min(每孔200 μl)； 消化293T，24孔板每孔鋪15萬細胞。可將細胞混勻，體積擴大15萬細胞/500 μl，加入1 000×的聚凝胺(終濃度10 μg/ml)混勻，每孔加入500 μl即可；設兩個感染梯度，分別取2 μl和5 μl病毒液加入24孔板的一孔中，搖勻后放入培養箱，48 h后即可觀察其熒光，計算滴度。48 h后15萬細胞可達到完全匯合狀態，同時計算病毒滴度。加入4%多聚甲醛(PFA)固定30 min，24孔板每孔200 μl； 用0.1%聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)洗2次，每次5 min； 用PBS將4，6二脒基-2-苯吲哚鹽酸(DAPI)稀釋1 000倍，每孔加入200 μl，避光室溫靜置5 min。在熒光顯微鏡下計數。病毒滴度(IU/ml)=熒光細胞數占總細胞數的百分比÷加入的病毒上清體積(μl)×1.5×105×103。超速離心27 000 r/min,90 min,4℃。用PBS重新溶解病毒顆粒(需在4℃放置超過24 h才能溶解)。病毒濃縮： 收集48 h上清，4 ml/T25瓶，放置4度，收集72 h上清，4 ml/T25瓶。4 000 r/min，4℃離心5 min，去碎片。加入5×的病毒濃縮液，混勻，4℃放置>12 h。4℃離心，1 500g，30 min，上清再次離心，1 500 r/min，5 min。分別加200 μl慢病毒溶解液(MEM)溶解。將納入的鱗癌、腺癌和支氣管肺泡患者切除的組織和正常組織通過上述試驗方法檢測XIAP的表達。

1.5病毒轉染293T細胞后顯微鏡下觀察XIAP、Caspase-9染色 建立穩轉XIAP、Caspase-9基因的肺癌細胞株 用293T細胞包裝出EFRT慢病毒(LV-EFRT)，濃縮后感染NCI-H460肺癌細胞株，用玻璃微管挑出有紅熒光的克隆，克隆經單細胞傳代，長出的克隆再次用玻璃微管挑出有紅熒光的克隆進行純化，純化的細胞擴增得到穩定轉染的細胞株。

1.6統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1XIAP基因在正常組織和NSCLC組織中的表達 NSCLC組織中XIPA表達明顯高于正常組織，顯示XIAP在胞質中呈黃棕色或黃色，藍色為細胞核；NSCLC組織中的XIAP表達明顯高于正常組織(P<0.05)，且上述3種NSCLC切除組織中的XIAP基因表達情況均高于正常組織。見表1，圖1。

2.2正常肺組織和NSCLC組織中Caspase-9的表達 正常肺組織中的Caspase-9的表達明顯高于NSCLC組織，且此基因主要表達為細胞核和胞質中，呈黃棕色和黃色等；正常肺組織中Caspase-9表達顯著高于NSCLC組織(P<0.05)，且上述3種正常肺組織中的Caspase-9基因表達情況均高于NSCLC組織。見表1、圖2。

表1 各組XIAP、Caspase-9表達比較

圖1 正常肺組織XIAP表達低于NSCLC組織(×200)

圖2 正常肺組織中的Caspase-9表達明顯高于NSCLC組織(×200)

2.3病毒轉染293T細胞后顯微鏡下觀察XIAP、Caspase-9染色 病毒轉染293T細胞后顯微鏡下觀察，用BamHI和SalI對質粒XIAP進行雙酶切，回收片段中紅色熒光代表轉染成功。用BamHI和SalI對質粒Caspase-9進行雙酶切，回收片段2，紅色熒光代表轉染成功。見圖3。

圖3 病毒轉染293T細胞后顯微鏡下觀察XIAP、Caspase-9染色(×100)

3 討 論

肺癌是如今在臨床上常見的具有較高死亡率的惡性腫瘤疾病之一，而該類腫瘤患者中大約80%以上均屬于NSCLC〔2，3〕。大量臨床經驗及研究表明，當NSCLC處于晚期階段時其治愈的概率較小，而處于Ⅰ期的NSCLC通過徹底的手術根除治療后生存時間超過5年的患者比例可達到60%～80%。因此對NSCLC的及早正確診斷是保證其治療及預后效果的主要因素之一。肺癌發病率每年呈顯著性升高，且我國肺癌人群5年生存率僅為19.7%。影像學在臨床中診斷肺癌占據重要地位，但影像學診斷在發現病變和定性中存在局限性。據不完全統計〔4〕，全國近50年以來肺癌患者已逐漸超過胃癌與肝癌，肺癌已成為現今病發病死高峰時代，也逐漸變成腫瘤當中第一位。據相關數據〔5〕顯示，惡性腫瘤男性發病率及死亡率超過女性發病率及死亡率。臨床數據〔6，7〕顯示，肺癌中，NSCLC占85%，患者生存率5年內僅為15%。小細胞肺癌患者2年內僅為1%的生存率。相關〔8〕顯示，部分患者經醫院確診后腫瘤標志物已經開始逐漸轉移及腫瘤局部晚期(Ⅲb/Ⅳ期)，晚期患者與遠處轉移患者已失去最佳手術治療時間。臨床肺癌患者癥狀不明顯及影像檢查呈現陰性時，患者血清腫瘤標志物會逐漸升高，當腫瘤標志物升高時檢測，將提高肺癌診斷率。有研究〔9〕發現XIPA基因表達與急性白血病患者的死亡存在明顯關聯，且證實XIAP基因表達水平高者存活率明顯低于XIAP水平低者。腫瘤患者在化療或治療過程中XIAP均表現為不同程度升高。NSCLC中使用低劑量照射可造成XIAP表達升高，并可誘發放射凋亡抵抗。相關研究〔10〕用XIAP腺病毒感染卵巢上皮性細胞癌，證明XIAP在卵巢上皮性癌系中具有抑制細胞凋亡的作用。本實驗發現正常肺組織中XIAP表達明顯低于NSCLC組織，與具體那種類型NSCLC無關，可能與疾病早期診斷、治療及預后的關系存在一定的關系。Caspase屬于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族的成員。有研究〔11〕發現Caspase參與了多種疾病的發生和發展，且在自身免疫性疾病和腫瘤中表現尤為顯著。Caspase-9基因定位于1p36.3～p36.1，編碼的蛋白產物分子量約為46 000 D，廣泛表達于人類的正常組織，如神經組織、肌肉組織、肝臟、脾臟和肺等〔12〕，目前在肺癌國內較少研究其蛋白水平的表達研究〔13〕。本實驗發現NSCLC組織中的Caspase-9蛋白表達較正常肺組織的明顯下調與轉染結果一致，提示凋亡基因Caspase-9蛋白減低與NSCLC的發生相關，證明了在NSCLC患者中XIAP在凋亡通路中通過抑制其核心蛋白Caspase的作用。有學者〔14〕提出Caspase-9可能與疾病早期診斷、治療及預后存在一定的關系。而是否同時檢測2種蛋白會增加特異性及敏感性仍需進一步研究。

綜上所述，XIAP和Caspase-9與NSCLC的發生、發展密切相關；XIAP和Caspase-9在NSCLC組織之間有統計學意義，預示著可能與和NSCLC的早期診斷與預后可能有關，可能為NSCLC治療提供新的治療靶點。