海藻酸鈉復合工程化軟骨細胞對兔佐劑性關節炎關節滑膜轉錄因子RORγt mRNA、 Foxp3 mRNA表達的影響

易偉 張旭東，2 蔣雯雯 韋登明

(1寧波大學醫學院病理學系，浙江 寧波 315211;2湖北醫藥學院實驗動物中心)

類風濕關節炎(RA)是一種常見病和多發病，但其發病機制仍然不是十分清楚。近年來研究表明RA的發生與輔助性T細胞17型/調節性T細胞(Th17/Treg)的失衡有關〔1，2〕。維甲酸相關核孤受體(ROR)γt mRNA通過調控Th17細胞，增加其分泌白細胞介素(IL)-17、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種細胞因子的水平而加重炎癥反應。Treg細胞是一類CD4+T細胞亞群，受轉錄因子叉頭蛋白(Fox)p3 mRNA調控，Treg可通過分泌抑炎因子(IL-10、TGF-β、IL-35等)來抑制免疫應答和炎性反應〔3〕。前期研究表明海藻酸鈉復合工程化軟骨細胞可修復兔佐劑性關節炎軟骨缺損，并且有明顯的抗炎作用，但其抗炎作用不是十分清楚〔4〕。而海藻酸鈉復合工程化軟骨細胞對于RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的影響未見報道。本文旨在探討海藻酸鈉復合工程化軟骨細胞調節RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平抗兔佐劑性關節炎的機制。

1 實驗材料

1.1實驗動物 從浙江省余姚泗門鎮建飛實驗兔養殖場〔許可格證號：SCXK(浙)2012-0050〕購入40只新西蘭兔(清潔級，二月齡，體重2～3 kg，雄性)。適應性飼養1 w后，隨機分為對照組(A組)，模型組(B組)，細胞治療組(C組)，支架治療組(D組)，支架復合細胞組(E組)各8只。

1.2實驗試劑 轉化生長因子(TGF)-β酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司)；兔抗TGF-β1多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；TGF-β1、胰島素樣生長因子(IGF)-1(美國peprotech公司)；阿利新藍(上海生工生物工程有限公司)；EasyPure?RNA Kit、2×TransTaq?High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix、EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)；完全弗佐劑(FCA)、海藻酸鈉粉劑(美國sigma公司)；UltraPower?DNA染料、6×上樣緩沖液(北京百泰克生物技術有限公司)。

1.3實驗儀器 臺式超高速低溫離心機(Centrifuge 5810R，德國Eppendorf 公司)、二氧化碳細胞培養箱(美國ThermoFisher Scientific公司)、包埋機(BM-Ⅶ，宏業醫用儀器公司)、石蠟切片機(HM-325，德國LEICA公司)、PCR儀(3522，購于德國Eppendorf 公司)、全波長酶標儀(美國ThermoFisher Scientific公司)、電泳儀(DYY-11B，北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(Molecular Image Gel Doc，購于美國Bio-Rad公司)。

1.4實驗方法

1.4.1兔佐劑性關節炎(AA)模型制備 20%烏拉坦靜脈按5 mg/kg的劑量注入麻醉動物，麻醉起效后，將0.5 ml FCA注入動物膝關節，14 d后再次注入FCA。3 w后察看兔子膝關節，若紅腫增粗則造模成功。

1.4.2種子細胞的誘導分化 從兔骨髓中穿刺抽取間充質干細胞誘導分化為軟骨細胞，其過程包含分離純化、培養與誘導分化、鑒定等操作〔4〕，其主要步驟：兔骨髓液抽取：用10%烏拉坦麻醉動物后，抽取膝關節骨髓液5 ml左右。自體骨髓間充質干細胞的分離：用等量percoll淋巴細胞分離液與抽取的骨髓液混合，以2 000 r/min離心15 min，吸取8 ml培養液加入并充分混勻，1 200 r/min，離心5 min，棄上清液，重復一次，將percoll分離液洗去，移入培養瓶置于二氧化碳培養箱(37℃，5%CO2)中培養。軟骨細胞的誘導：培養48 h后，骨髓間充質干細胞呈梭形渦旋狀分布，細胞生長至80%～90%時，胰蛋白酶消化貼壁細胞并傳代培養。至P3代自體骨髓間充質干細胞生長至培養瓶80%左右時，在常規培養液中加入約10%的誘導劑換液培養細胞，約2 w后自體骨髓間充質干細胞絕大部分可誘導成軟骨細胞。軟骨細胞的鑒定：軟骨細胞多呈現星形、多角形。阿利新藍染色時細胞呈藍色即陽性。

1.4.3種子細胞與支架的混合 于24孔培養板中每孔加入400 μl的6%的海藻酸鈉凝膠與培養基的混合物，再加入1%CaCl2溶液20 μl，于15 min后吸取全部的CaCl2后加入細胞培養液。將支架與種子細胞懸液放入20 ml注射器內，抽注射器讓細胞懸液與支架材料混勻后培養。

1.4.4支架復合物的治療 實驗動物耳緣靜脈麻醉后，A組、B組于關節腔內注入0.5 ml生理鹽水；C組注入等量海藻酸鈉支架；D組注入等量軟骨細胞；E組注入等量支架復合軟骨細胞。

1.4.5兔膝關節滑膜蘇木素-伊紅(HE)染色 治療30 d后處死動物，取兔子膝關節，甲醛溶液固定后脫鈣，取材，經過水洗、脫水透明、切片脫蠟、HE染色等操作，光學顯微鏡下觀察。

1.4.6ELISA檢測外周血細胞因子TGF-β1、IL-10、IL-22表達 用兔外周血3 ml離心后取上層液，按照試劑盒說明書用ELISA檢測外周血細胞因子TGF-β1、IL-10、IL-22表達。

1.5RT-PCR檢測Foxp3 mRNA和RORγt mRNA 的表達 使用Trizol法提取總RNA。用2 μl ddH2O調零，吸取2 μl RNA，測定RNA溶液260/280的比值和濃度。逆轉錄合成cDNA按說明書操作。RT-PCR使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計，合成，純化。RORγt mRNA引物：上游：5′-TCTGGAAGCTGTGGGATAGA-3′；下游：5′-GAGGAGCCTGTGGAGAAATAC-3′。Foxp3 mRNA引物：上游：5′-GGCCCTTCTCCAGGACAGA-3′；下游：5′-GCTGATCATGGCTGGGTTGT-3′。GAPDH：上游：5′-CCTCATGCCATCCTGCGTCT-3′；下游：5′-GCCACAAGGATTCCATACCCA-3′。PCR體系如下：cDNA 5 μl；上游引物(10 μmol/L)1 μl；下游引物(10 μmol/L)1 μl；2×TransTaq?HiFi PCR SuperMix25 μl；ddH2O 18 μl；總計50 μl。PCR條件：94℃ 30 s預變性；94℃ 5 s，60℃ 30 s，35個循環。最后進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.6統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，Dunnett-t檢驗。

2 結 果

2.1AA模型制備結果 B組關節外觀紅腫，其內可見增生現象和積液，并見乳白色軟骨。A組關節無紅腫，可見透明軟骨，未見增生現象。

2.2細胞的培養鑒定 間充質干細胞培養P3代成功后，加入誘導液使其分化成軟骨細胞，用阿利新藍染色，藍色顯示誘導成功。

2.3關節滑膜的HE染色結果 A組關節滑膜無異常，無炎細胞，B組炎細胞較多，C組、D組、E組較B組炎癥情況均有所改善。

2.4各組兔外周血中TGF-β1、IL-10、IL-22的ELISA檢測結果 與B組相比，A、E組兔外周血TGF-β1水平明顯多(P=0.002，P<0.007)，C組及D組TGF-β1差異無統計學意義(P>0.05)。各組外周血IL-10、IL-22水平與B組比較無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.5RT-PCR檢測各組兔滑膜中Foxp3 mRNA與RORγt mRNA的表達量水平比較 與B組相比，A組兔關節滑膜中Foxp3 mRNA的表達水平高(P<0.05)，RORγt mRNA表達水平明顯低(P<0.01)，C組和D組Foxp3 mRNA表達水平無差異(P>0.05)，E組Foxp3 mRNA表達水平高于B組(P<0.05)，C、D、E組RORγt mRNA表達水平明顯低于B組(P<0.05，P<0.01)。見表2、圖1。

表2 各組免滑膜中Foxp3、RORγt mRNA表達比較

圖1 兔關節滑膜中Foxp3、RORγt mRNA電泳條帶

3 討 論

骨髓間充質干細胞可通過改變生長環境誘導形成軟骨細胞，再與海藻酸鈉支架復合成組織工程化細胞，對佐劑性關節炎有明顯的抗炎療效〔4，5〕。海藻酸鈉支架不僅可以給軟骨細胞的增殖分化提供適宜的場所，而且與滑膜有較好的生物相容性，其降解產物無毒，是目前作為支架材料的完美選擇〔5～7〕。

目前一致認為RA和病人關節中的淋巴細胞及其分泌的多種炎癥因子聯系密切〔8〕。最近研究表明Th17/Treg和RA的發生密切相關，上述2種細胞對RA患者關節軟骨的破壞產生重大影響，已有研究表明〔9，10〕，Th17/Treg介導RA的免疫反應。初始T細胞可分化為Th17或Treg，Th17受RORγt mRNA調控，而低濃度的 TGF-β1和 IL-6 可共同誘導 RORγt 的表達。Th17可產生IL-17、IL-6、IL-22等，其中IL-17是主要的促炎效應因子，關節破壞與IL-17有關，并且IL-17還可通過活化滑膜細胞及上調造血因子的表達致使滑膜增生，加重RA的發生發展〔11，12〕。Treg可增加機體的自身耐受且保持對炎癥因子的免疫無反應性〔13〕。本研究結果提示海藻酸鈉支架或工程化軟骨細胞均有一定的抗炎作用。支架復合軟骨細胞可提高關節滑膜Foxp3 mRNA表達水平降低RORγt mRNA表達水平從而起到抗炎作用。

TGF-β1是影響初始T細胞向Th17/Treg的分化的主要因素。TGF-β1低表達可與IL-6共表達增加Th17的分化，TGF-β1高濃度增加Treg的分化〔14〕。本研究結果提示TGF-β1可能通過影響RORγt mRNA、Foxp3 mRNA進而影響初始T細胞的分化方向來影響各組RA的發生發展。

IL-10是T細胞和APC的抑制因子，能夠改善RA滑膜炎癥情況，下調破骨細胞的激活，也可減輕關節腫脹程度，改善軟骨損壞情況。但也有研究表明IL-10可增加成熟B細胞數量并阻止B細胞凋亡從而達到致炎作用。目前有研究表明〔15～17〕關于RA患者血清中IL-10的檢測結果不一致，表達量有升高也有降低的。本研究結果顯示，與B組相比，各組血清中IL-10的表達量無變化。造成此現象的原因可能有實驗動物是兔，與RA患者存在表達上的區別，其次IL-10主要表面在滑膜細胞膜上或存在于滑液中，而關節的營養供應不足，較小范圍的炎癥反應未能觸發機體的免疫調節功能，本實驗檢測的是血清中的IL-10。關于RA患者中外周血IL-10與RA的關系需要更多實驗加以驗證研究。

IL-22由Th1、Th17、Th22等細胞產生，在RA進程中起重要作用。IL-22與骨破壞X線分期呈正向關聯(P<0.05)，是骨破壞的危險因素，可用于評價RA的病情〔18〕。對RA患者外周血IL-22檢測結果顯示，RA組IL-22濃度高于對照組(P<0.05)〔19〕；RA患者滑膜組織檢測結果顯示，與健康人相比，IL-22 mRNA的表達水平增加，IL-22受體的轉錄水平也隨之增加〔20〕。本研究結果與以往研究不同的原因可能是機體是一個協調統一的整體，一個免疫反應發生，其對應的免疫調節也應激產生，使機體維持在一定的平衡之中。滑膜炎癥的產生使機體中抑炎因子也會相應分泌，而局部炎癥未能引發全身免疫調節反應，因此血清中IL-22可能無明顯變化。