miR-217靶向SPRY1調控血管內皮細胞增殖和凋亡的分子機制

張典文 王培翠 武文輝

(青島市海慈醫療集團 1心血管二科，山東 青島 266000；2功能檢查科心電圖室)

動脈粥樣硬化(AS)通常會導致心臟病發作、腦卒中甚至死亡〔1，2〕。在動脈中有斑塊形成時，流向某些器官的血液通常受到阻礙。目前AS與心血管疾病的發病機制密切相關，被認為是世界范圍內的主要死亡原因〔3，4〕。miRNA為短鏈的非編碼微小RNA，在機體多種疾病的發生發展中占重要地位〔5〕。據報道，miR-217在人類的多種癌癥中均有表達，在心血管疾病中也有報道〔6，7〕，但具體的作用機制尚未十分清楚。軟脂酰化磷蛋白Sprouty(SPRY1)可負向調控多種信號通路的調控，如MAPK、MAPK/ERK、FGF、EGF等〔8，9〕。SPRY1與miR-217在心血管疾病中的作用機制尚未清楚。本研究將構建高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞EAhy926損傷，檢測其中miR-217、SPRY1的表達，探討miR-217調控高糖誘導的EAhy926細胞進一步發展的功能機制。

1 材料與方法

1.1材料 人臍靜脈內皮細胞EAhy926購自美國菌種保藏中心；改良都市培養基(DMEM)購自invitrogen；噻唑藍(MTT)購自MCE；LipofectamineTM2000購自日本Takara；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore；RIPA蛋白裂解液購自南京建成生物研究所；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自上海生工生物工程；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega。

1.2細胞培養 將人臍靜脈內皮細胞EAhy926用混有血清的DMEM在常規條件下培養、傳代。

1.3細胞模型的建立與分組 按照徐茂鳳等〔10〕的方法，用25 μmol/ml高糖處理EAhy926細胞12 h為HG組。用5 μmol/ml高糖處理EAhy926細胞12 h為NG組。將anti-miR-con、anti-miR-217、pcDNA、pcDNA-SPRY1、anti-miR-217+si-con、anti-miR-217+si-SPRY1用3～5倍脂質體混勻，轉染至EAhy926細胞，然后再用25 μmol/ml的高糖處理，分別為HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-217組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA-SPRY1組、HG+anti-miR-217+si-con組、HG+anti-miR-217+si-SPRY1組，轉染8 h后，添加培養基繼續培養至48 h，用qRT-PCR確認轉染效率良好，以用于后續試驗。

1.4qRT-PCR實驗檢測miR-217、SPRY1表達 收集細胞，提取總RNA并反轉錄為cDNA，將其作為模板用于qRT-PCR試劑盒檢測miR-217、SPRY1表達。結果用2-△△Ct計算miR-217、SPRY1的表達水平。引物信息(5′-3′)：miR-217上游引物TGCCATGAAATAAATGTCTGTGC，下游引物AGGTGTTTTAGCATCTTGGGC；SPRY1上游引物GAGGCCAGAGCTCAGAGTGGCAAC，下游引物TGTTGGTTTTTCAAAGTTCCTAGG。內參U6和GAPDH的引物為常用引物序列，由上海吉瑪公司合成。

1.5Western印跡實驗檢測細胞SPRY1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達 收集細胞，提取總蛋白并變性后，取上清用于蛋白電泳，然后將蛋白用轉膜儀轉移到PVDF膜；將膜用2.5%脫脂奶粉封閉處理，加入Ⅰ抗(1∶500～1∶1 500)4℃過夜，再加Ⅱ抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。最后用ECL發光試劑盒顯影曝光。蛋白條帶的灰度表示蛋白的表達水平。

1.6MTT法檢測細胞增殖 收集細胞，取約104個細胞置于24孔板中加入MTT反應溶液和二甲基亞砜(DMSO)溶液，在490 nm波長下檢測細胞的吸光度(A)。

1.7Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡 收集各組細胞，洗滌后用結合緩沖液懸浮，再加入Annexin V-FITC、PI各5 μL避光反應，上流式細胞儀檢測凋亡情況。細胞的凋亡率為早期凋亡率和晚期凋亡率之和。

1.8生物信息學分析 采用在線靶基因預測庫 target scan(http：//www.targetscan.org/)網站預測miR-455-3p的靶基因。

1.9雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-217與SPRY1的靶向結合 根據上述預測到的結合位點設計合成含有結合位點的質粒(SPRY1-WT)和突變序列(SPRY1-MUT)，送由吉瑪公司完成。將SPRY1-WT、SPRY1-MUT克隆至熒光素酶報告載體psiCHECK2，構建熒光報告質粒。將其與miR-NC、miR-217共轉染，然后檢測細胞的熒光素酶活性。具體操作方法按照雙熒光素酶報告基因實驗檢測試劑盒要求操作，記錄螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以二者的比值表示miR-217與SPRY1的結合力。比值越小結合力越強，比值越大結合力相對較弱。

1.10統計學處理 使用軟件PEMS3.2進行單因素方差分析、SNK-q檢驗及t檢驗。

2 結 果

2.1高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞中miR-217和SPRY1表達的影響 與NG組比較，HG組miR-217發生明顯升高，SPRY1 mRNA表達和蛋白表達均明顯下調(P<0.05)。見表1,圖1。

表1 miR-217和SPRY1在高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞中表達

圖1 Western印跡檢測人臍靜脈內皮細胞SPRY1蛋白表達

2.2抑制miR-217調控高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞增殖 與NG組比較，HG組miR-217表達顯著升高，細胞活性顯著降低，P21蛋白表達明顯降低(均P<0.05)；與HG+anti-miR-con組比較，HG+anti-miR-217組miR-217表達明顯下調，細胞活性明顯上調，P21蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖2和表2。

圖2 Western印跡檢測人臍靜脈內皮細胞p53和p21蛋白表達

表2 干擾miR-217和高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響

2.3抑制miR-217調控高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡 與NG組相比，HG組細胞凋亡率明顯上調，Bax蛋白表達明顯上調，Bcl-2蛋白表達顯著下調(均P<0.05)；與HG+anti-miR-con組比較，HG+anti-miR-217組凋亡率明顯下調，Bax蛋白表達顯著下調，Bcl-2蛋白表達顯著上調(P<0.05)，見圖3，圖4，表3。

圖3 流式檢測細胞凋亡

圖4 Western印跡檢測凋亡相關蛋白

表3 干擾miR-217和高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響

2.4miR-217靶向SPRY1 運用target scan數據庫預測到miR-217與SPRY1 3′UTR之間存在結合位點(圖5)；miR-217明顯抑制WT-SPRY1細胞的熒光素酶活性(P<0.05)，不影響MUT-SPRY1細胞的熒光素酶活性(P>0.05)；miR-217組SPRY蛋白表達(0.18±0.03)顯著低于miR-con組(0.61±0.07);anti-miR-217組(0.88±0.09)顯著高于anti-miR-con(0.64±0.06)，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖6，表4。

圖5 miR-217靶向SPRY1 3′UTR的序列信息

圖6 Western印跡檢測人臍靜脈內皮細胞SPRY1蛋白表達

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5過表達SPRY1調控高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞增殖凋亡 與NG組比較，HG組SPRY1蛋白表達明顯降低，細胞活性明顯下調，細胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白表達顯著上調，Bcl-2和p21蛋白表達明顯下調(均P<0.05)；與HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-SPRY1組SPRY1蛋白表達明顯上調，細胞活性顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白表達明顯下降，Bcl-2和p21蛋白表達均明顯上升(均P<0.05)，見圖7和表5。

圖7 Western印跡檢測人臍靜脈內皮細胞SPRY1、Bax、Bcl-2和p21蛋白表達

表5 過表達SPRY1和高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡的影響

2.6干擾miR-217和沉默SPRY1對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡的影響 與NG組比較，HG組SPRY蛋白表達下調，細胞活性下降，細胞凋亡率上升，差異均有統計學意義(P<0.05)；與HG+anti-miR-con組比較，HG+anti-miR-217組SPRY蛋白表達上升，細胞活性上調，細胞凋亡率下降，差異均有統計學意義(均P<0.05)；與HG+anti-miR-217+si-con組比較，HG+anti-miR-217+si-SPRY1組SPRY蛋白表達下降，細胞活性降低，細胞凋亡率上升，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表6和圖8。

表6 干擾miR-217和沉默SPRY1對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡的影響

2.7抑制miR-217聯合沉默SPRY1調控高糖誘導人臍靜脈內皮細胞增殖相關蛋白和凋亡相關蛋白 與NG組比較，HG組Bax蛋白表達上調，Bcl-2、p21蛋白表達下調，差異均有統計學意義(均P<0.05)；與HG+anti-miR-con組比較，HG+anti-miR-217組Bax、Bcl-2、p21蛋白表達發生相反的調控，差異均有統計學意義(均P<0.05)；與HG+anti-miR-217+si-con組相比，HG+anti-miR-217+si-SPRY1組Bax、Bcl-2、p21的蛋白表達發生與HG組相同的調控作用。見圖9，表7。

圖9 Western印跡檢測人臍靜脈內皮細胞SPRY1、Bax、Bcl-2和p21蛋白表達

表7 干擾miR-217和沉默SPRY1對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞SPRY1、Bax、Bcl-2和p21蛋白影響

3 討 論

miRNA在人類的各種疾病中均具有重要的調控作用，包括心力衰竭、心肌梗死及心血管其他疾病〔11〕。miR-217參與多種腫瘤的發生發展，在心血管疾病中也具有重要作用。Zhang等〔12〕研究發現，miR-217在心臟黏液瘤中的表達異常降低，過表達miR-217可抑制癌細胞的增殖，促進凋亡，其作用機制與miR-217靶向調控白細胞介素(IL)-6的表達。劉宇等〔13〕研究報道，在高糖誘導的內皮細胞中miR-217的表達水平明顯上調，可靶向與內皮細胞功能相關的多個靶基因的表達。本研究結果與劉宇等〔13〕研究結果相一致，進一步研究發現，抑制miR-217可促進高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞增殖，抑制其凋亡，這是首次發現miR-217在高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞中的功能，為miR-217在高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞中的潛在價值的開發奠定基礎；深入研究，驗證了miR-217可靶向負調控SPRY1的表達，為miR-217在高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞中的調控機制的探索提供參考依據。

SPRY1為Spry 基因家族的一員，具有該家族的抑制血管生成作用〔14，15〕。Friesel等〔16〕報道，SPRY1上調可抑制人臍靜脈內皮細胞Matrigel上的管形成、抗血管生成因子、絲氨酸蛋白酶抑制劑肽酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑f1。Yang等〔17〕報道，Spry1對MAPK/ERK信號傳導幾乎沒有影響，但在血管平滑肌細胞中增加并維持Akt活化，體外血管平滑肌細胞標志物表達需要持續的Akt信號傳導，而ERK信號傳導負調節Akt活化和血管平滑肌標志物基因表達。Lu等〔18〕通過ApoE建立小鼠血管內皮細胞損傷模型，SPRY1在AS組織中的表達水平明顯降低，且可作為miR-29b的靶基因調控人臍靜脈內皮細胞的炎性因子表達及MAPK信號通路的活性，提示miR-29b/SPRY1/MAPK信號通路具有治療AS的潛力。本研究結果與前人研究結果均相一致；過表達SPRY1后，具有與抑制miR-217表達對高糖誘導的損傷的內皮細胞的增殖促進和凋亡抑制的相同作用，這與SPRY1在AS中的抗炎保護作用相呼應，為SPRY1的功能研究提供了新的理論參考；深入研究發現，沉默SPRY1可逆轉抑制miR-217對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞的增殖促進和凋亡抑制作用，說明不僅miR-217可靶向抑制SPRY1的表達，SPRY1也可逆向負調控miR-217對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞的表達和功能。

綜上，抑制miR-217可促進高糖誘導人臍靜脈內皮細胞的增殖，抑制其凋亡，產生這種作用的機制與miR-217靶向負調控SPRY1的表達有關，為糖尿病心血管疾病的治療提供新方向。