老年乳腺癌患者新輔助化療后原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤標(biāo)志物表達(dá)比較

周祥敏 鄭元停 (三亞市婦幼保健院檢驗(yàn)科，海南 三亞 572000)

早期乳腺癌患者不會(huì)出現(xiàn)特異性臨床表現(xiàn)和體征，導(dǎo)致大部分患者就診時(shí)病情已發(fā)展至中晚期。此外，由于老年患者各器官功能逐漸衰退，機(jī)體免疫力和抵抗力降低，相較于中青年乳腺癌患者，一般預(yù)后較差〔1,2〕。新輔助化療是臨床治療局部晚期乳腺癌或使腫瘤縮小后爭(zhēng)取保留乳房手術(shù)的有效手段，與傳統(tǒng)輔助化療相較而言，新輔助化療更有利于降低腫瘤分期，提高手術(shù)和保留乳房的概率，可有效控制癌細(xì)胞向全身擴(kuò)散，從而提高生存期〔3〕。有研究表明，乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的分子標(biāo)志物表達(dá)水平不同，且臨床治療方案存在一定差異性〔4〕。本研究旨在探討老年乳腺癌患者新輔助化療后原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2019年1～7月于三亞市婦幼保健院接受新輔助化療的老年乳腺癌患者82例的臨床資料。年齡61～79歲，平均(69.42±2.74)歲；體重指數(shù)17～27 kg/m2，平均(23.42±1.12)kg/m2；文化程度：17例初中及以下，36例高中/中專，29例大專及以上；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌67例，浸潤(rùn)性小葉癌15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)老年乳腺癌治療專家共識(shí)(2018)》〔5〕內(nèi)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診者；②認(rèn)知功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神疾病史；②合并其他惡性腫瘤；③免疫系統(tǒng)疾病；④血液系統(tǒng)疾??；⑤合并心、肝、腎等重要臟器功能嚴(yán)重?fù)p害。

1.2方法 所有患者接受新輔助化療后的腫瘤組織標(biāo)本，采取完畢后需在離體30 min內(nèi)送至檢查，以5 mm為間距將大體標(biāo)本切開，并將其放置固定于10倍體積的4%中性甲醛緩沖溶液中，時(shí)間6～48 h，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋等操作，5 μm切片。選用3%過氧化氫(H2O2)室溫溫育5～10 min，對(duì)內(nèi)源性過氧化物酶的活性進(jìn)行滅活，并給予磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗，重復(fù)3次，2 min/次；之后分別將Ki-67、人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)2及孕激素受體(PR)一抗工作液滴加入，在37℃環(huán)境下進(jìn)行溫育，溫育時(shí)間1～2 h，或在4℃環(huán)境下過夜；再給予PBS進(jìn)行沖洗，共3次，2 min/次，將聚合物輔助劑(Polymer Helper)滴入，室溫或37℃室溫溫育20 min，給予PBS沖洗，共3次，2 min/次，滴加多聚過氧化物酶抗鼠及抗兔抗體，室溫或室溫37℃溫育20～30 min，再次采用PBS沖洗，共3次，2 min/次。最后選用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液進(jìn)行顯色，4～8 min，再給予自來水進(jìn)行反復(fù)沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水透明、封片，并采用顯微鏡進(jìn)行觀察。雌激素受體(ER)、PR及Ki-67采用全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)(上海精密儀器儀表有限公司，型號(hào)：MY2300)進(jìn)行染色評(píng)估，且采用乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)時(shí)間為20 min。根據(jù)《ASCO/CAP 乳腺癌激素受體 IHC檢測(cè)指南》〔6〕中標(biāo)準(zhǔn)作為ER、PR結(jié)果判斷陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及陽(yáng)性強(qiáng)度≥1%腫瘤細(xì)胞核陽(yáng)性為陽(yáng)性，若腫瘤細(xì)胞核染色<1%為受體陰性表達(dá)。采用美國(guó)Abbott公司所提供的雙探針試劑盒及全自動(dòng)免疫組化機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司，型號(hào)：BOND MAX)對(duì)HER2受體進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)，并在37℃環(huán)境下溫育24 min，蘇木精復(fù)染。采用ASCO/CAP指南標(biāo)準(zhǔn)〔7〕判定：無著色細(xì)胞或10%腫瘤細(xì)胞呈模糊不清/微弱、不完整的細(xì)胞膜著色為陰性；存在高于10%的腫瘤細(xì)胞為弱至中等強(qiáng)度和(或)不完整細(xì)胞膜著色，或存在不高于10%的腫瘤細(xì)胞呈強(qiáng)度、完整細(xì)胞膜著色為不確定；多于10%細(xì)胞呈強(qiáng)度、完整細(xì)胞膜著色為陽(yáng)性。對(duì)(不確定)的患者進(jìn)行光原位雜交(FISH)檢測(cè)，依據(jù)組織學(xué)及免疫組織化學(xué)切片定位，選取4 mm×4 mm的浸潤(rùn)癌組織，當(dāng)切片不均勻染色時(shí)，選取不同代表區(qū)域?qū)Ρ壤M(jìn)行記錄。處理石蠟切片，選用80℃、1 mmol/L硫氰酸鈉(NaSCN)液進(jìn)行熱修復(fù)，修復(fù)時(shí)間為30 min，0.1 mg/ml蛋白酶K 37℃消化10 min，采用核酸雜交漂洗液對(duì)切片進(jìn)行漂洗，漂洗時(shí)間5 min，在室溫環(huán)境下干燥切片；將10 μl雜交液滴入，放置于雜交儀中孵育16 h，溫度為42℃。切片經(jīng)0.1%NP-40/2×SSC洗滌5 min，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核。觀察切片，并對(duì)圖像進(jìn)行采集。每張切片需確保至少4個(gè)區(qū)域、共20～80個(gè)浸潤(rùn)性乳腺癌腫瘤細(xì)胞，對(duì)每個(gè)細(xì)胞核HER2及CEPl7信號(hào)數(shù)量進(jìn)行記錄，計(jì)算HER2、17號(hào)染色體著絲粒探針(CEP17)的平均拷貝數(shù)及HER2/CEP17比值。并對(duì)其陰陽(yáng)性進(jìn)行判斷，陰性：HER2/CEP17<2.0且HER2平均拷貝數(shù)<4.0；不確定：HER2/CEP17<2.0且4.0≤HER2平均拷貝數(shù)<6.0；陽(yáng)性：HER2/CEP17≥2.0或HER2平均拷貝數(shù)≥6.0。Ki-67判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)St．Gallen國(guó)際乳腺癌會(huì)議共識(shí)進(jìn)行判斷〔8〕，低表達(dá)：Ki-67<14%；高表達(dá)：Ki-67≥14%。

2 結(jié) 果

2例乳腺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶ER存在表達(dá)差異，2例乳腺癌原發(fā)灶為陽(yáng)性，而轉(zhuǎn)移灶為陰性。7例乳腺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶PR存在表達(dá)差異，5例乳腺癌原發(fā)灶為陽(yáng)性，而轉(zhuǎn)移灶為陰性；2例乳腺癌原發(fā)灶為陰性，而轉(zhuǎn)移灶為陽(yáng)性。3例乳腺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶HER2存在表達(dá)差異，1例乳腺癌原發(fā)灶為陽(yáng)性，而轉(zhuǎn)移灶為陰性；2例乳腺癌原發(fā)灶為陰性，而轉(zhuǎn)移灶為陽(yáng)性。17例乳腺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶Ki-67存在表達(dá)差異，14例乳腺癌原發(fā)灶為陽(yáng)性，而轉(zhuǎn)移灶為陰性；3例乳腺癌原發(fā)灶為陰性，而轉(zhuǎn)移灶為陽(yáng)性。見表1。

表1 乳腺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中ER、PR、HER2、Ki-67表達(dá)變化(n)

3 討 論

乳腺癌是女性群體中高發(fā)的一種惡性腫瘤疾病，主要在老年女性群體中多見，且發(fā)病率及死亡率目前仍呈逐年遞增及年輕化趨勢(shì)，現(xiàn)已成為危害女性健康的重要疾病之一。乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程與性激素具有密切關(guān)系，而激素受體的發(fā)現(xiàn)是乳腺癌治療史上的里程碑之一〔9,10〕。

ER是一種與雌二醇結(jié)合后形成的蛋白分子，可與雌激素相互結(jié)合后形成復(fù)合物，且可轉(zhuǎn)向細(xì)胞內(nèi)，能夠參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和細(xì)胞的分裂增殖等多種生理過程中。PR是核受體超家族中的一種甾體激素受體，ER的表達(dá)水平與乳腺癌患者接受內(nèi)分泌治療的治療效果具有緊密關(guān)系，對(duì)兩種受體進(jìn)行檢測(cè)能夠?qū)颊呓邮軆?nèi)分泌治療的情況進(jìn)行精準(zhǔn)反饋，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)制定、選擇治療方案具有重要影響〔11〕。不同類型腫瘤存在原位癌演變?yōu)榻?rùn)癌，原發(fā)腫瘤隨著時(shí)間的自身演變及原發(fā)灶向轉(zhuǎn)移灶發(fā)展等3種情況的時(shí)間異質(zhì)性〔12,13〕。臨床認(rèn)為造成這種異質(zhì)性的原因較多，如標(biāo)本不同、實(shí)驗(yàn)室條件差異及不同檢測(cè)方法等客觀因素可能會(huì)造成人為誤差，而腫瘤生物學(xué)特性發(fā)生變化、以往治療史及受體之間的相互作用也會(huì)造成差異性。有研究表明，2/3的50歲以下乳腺癌患者可見ER或PR呈陽(yáng)性表達(dá)，而50歲以上的乳腺癌患者中有80%可見ER陽(yáng)性，表明ER和PR是乳腺癌患者臨床治療過程中對(duì)預(yù)測(cè)及預(yù)后進(jìn)行觀察的兩項(xiàng)重要參考指標(biāo)〔14〕。

HER2是目前研究較為透徹的乳腺癌基因之一，主要由922個(gè)腺嘌呤、1 382個(gè)胞嘧啶、1 346個(gè)鳥嘌呤及880個(gè)胸腺嘧啶構(gòu)成〔15〕。HER2蛋白是一種跨膜蛋白，具有一定的絡(luò)氨酸蛋白激酶活性，目前臨床認(rèn)為HER2基因擴(kuò)增是影響乳腺癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的重要因素之一，約有30%的乳腺癌患者中存在HER2基因過度表達(dá)，且與患者預(yù)后情況較差具有密切關(guān)聯(lián)。當(dāng)乳腺癌患者HER2過度表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)患者的病情發(fā)展，化療緩解期縮短且內(nèi)分泌的治療效果較差，生存率較低〔16〕。Ki-67是預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的重要參考指標(biāo)之一，可對(duì)腫瘤組織細(xì)胞增殖活性、組織細(xì)胞良惡性生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行反饋，有助于確定是否采用輔助性化學(xué)治療〔17〕。新輔助化療是臨床治療乳腺癌過程中較為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，是局部晚期乳腺癌的首選治療手段，現(xiàn)也常用于治療存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者及無法行保乳術(shù)但有保乳意愿的患者〔18〕。本研究結(jié)果表明老年乳腺癌患者新輔助化療后原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶ER、PR、HER2及Ki-67腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平存在差異，可實(shí)時(shí)對(duì)上述腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以對(duì)患者進(jìn)行最佳救治。