維生素A 修飾的納米載體靶向肝星狀細胞沉默TLR4 基因并抑制其激活的體外實驗研究

陳志偉，韓世松，安泳橙，周智美，陳 燁，林立騰，朱康順

肝纖維化是肝臟對各種原因導致的慢性損傷的一種修復反應，以細胞外基質（extracellular matrix，ECM）增生為特征［1］。 目前研究認為肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）活化是導致其發生的最關鍵環節。 正常肝臟HSC 是靜止的，含有大量維生素A（vitamin A，VA）脂質滴，肝組織損傷時活化的HSC 轉化為肌成纖維細胞，同時合成大量ECM［2-3］。肝纖維化發生、 發展與轉歸取決于ECM 合成和降解的凈效應。通過抑制HSC 活化減少ECM 生成，有望逆轉肝纖維化［4-5］。 因此開發針對活化 HSC 安全高效的靶向藥物可能是治療肝纖維化的有效方法之一。

Toll 樣受體（TLR）4-髓樣分化因子（MyD）88-核因子（NF）-κB 信號通路廣泛存在于各種組織細胞中，是介導炎性因子在細胞內和細胞間表達的重要信號通路之一［6］。脂多糖（LPS）是革蘭陰性細菌外膜的主要成分。 現有研究證明LPS 可通過TLR4 途徑大幅度誘導 HSC 活化，加重肝纖維化［7-9］。 在 LPS 誘導的HSC 活化過程中，TLR4 通過銜接分子MyD88激活導致NF-κB 異位，進而導致HSC 向肌成纖維細胞轉化，并上調各種促炎細胞因子。 另一研究也證實，TLR4 突變小鼠纖維化發生率會明顯降低［10］。上述研究均表明TLR4 信號通路在調節HSC 活化和增殖過程中起到了重要作用。 近年廣泛受到關注的 RNA 干擾（RNA interference，RNAi） 技術是一種調控基因表達的有效方法，但其臨床應用仍有較大限制，例如RNA 在體內易降解，較大分子量且帶有負電荷使其難以跨越細胞膜進入細胞內起作用等［11］。 為了解決上述難題，許多納米載體應運而生［12］，其中陽離子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）即為一種常用于生物醫學研究的納米載體［13］，具有很強的吸附能力，可用于負載小干擾RNA（siRNA），在體內外水平表現出良好的基因沉默功能［14］。 但 PEI 缺點之一是具有較強的細胞毒性，且對細胞輸送siRNA也不具有選擇性，因此單獨應用PEI 行基因藥物遞送的效果欠佳。 必須對PEI 進行適當修飾，降低其細胞毒性，同時賦予其靶向識別功能，才可能取得更好的療效［15］。

鑒于HSC 在肝纖維化過程中的重要作用，本研究選擇HSC 作為納米載體靶向細胞。 HSC 表面富含視黃醇結合蛋白（retinol binding protein，RBP）受體［16］，可負責攝取和儲存 VA。 已有研究通過利用VA 與RBP 受體相互作用，用VA 脂質體包載抑制前鞭毛體特異膜糖蛋白（gp46）siRNA 復合物，靶向HSC 并抑制 gp46 表達［17］。 本研究類似地制備一種由 VA 修飾的聚乙二醇（PEG）-PEI 聚合物膠束（VA-PEG-PEI）用于 siRNA HSC 靶向遞送，探索通過 VA-PEG-PEI 介導的 TLR4 siRNA（siTLR4）輸送在體外細胞水平實現對HSC TLR4/NF-κB 信號通路的靶向調控，從而為肝纖維化治療尋求一種新策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

實驗用主要試劑有HSC 細胞株（LX-2）（廣東藥科大學藥學院饋贈），有機化學原料PEG（上海芃圣生物科技公司），血清和DMEM 培養基（美國Gibco公司），雙抗（北京索萊寶科技公司），LPS（美國Sigma 公司），無功能陰性對照 siRNA（SCR）（生工生物工程上海公司），Cy3 標記的 SCR（SCR-Cy3）（美國Invitrogen 公司），瓊脂糖（粉末，香港 Gene 公司），溴化乙錠溶液（上海翊圣生物科技公司），乙酸三酯-乙二胺四乙酸（TAE）緩沖液（江蘇凱基生物技術公司），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（瑞士 Roche公司），TLR4 siRNA 單基因套裝（廣州銳博生物科技公司），細胞計數試劑盒（CCK）-8（日本 Dojindo Laboratories 公司），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）緩沖液（上海碧云天生物技術公司），抗 α- 平滑肌肌動蛋白（SMA） 兔單克隆抗體、抗TLR4 兔單克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），抗 NF-κB-p65 兔單克隆抗體（美國 CST 公司），超敏增強型化學發光（ECL）試劑盒（上海碧云天生物技術公司）。

1.2 LX-2 細胞培養和分組

LX-2 細胞置于含10%胎牛血清DMEM 培養基中，放入37℃、50 mL/L CO2孵育箱（相對濕度95%）中培養。 LX-2 細胞隨機分為對照組、LPS 處理組、PEG- PEI/siTLR4+LPS 處 理 組 、VA- PEG- PEI/siTLR4+LPS 處理組。其中對照組僅加入含血清和雙抗的DMEM 培養基培養，其余3 個處理組均預加入濃度為 0.1 μg/mL LPS 培養基 12 h。

1.3 VA-PEG-PEI 合成方法與操作步驟

參照文獻［18］報道方法合成納米載體復合物VAPEG-PEI，合成路線如圖1 所示。

圖1 納米聚合物VA-PEG-PEI 合成線路

1.4 VA-PEG-PEI 核磁共振波譜表征

通過VA 和PEG-PEI 酰胺化反應合成納米聚合物VA-PEG-PEI，作為siRNA 靶向納米載體。 將VA 和納米載體PEG-PEI 分別溶解于氘代水，用AVANCE Ⅲ HD-400 MHz 超導核磁共振波譜儀檢測兩者1H 化學位移。

1.5 聚合物Zeta 電位和水合粒徑檢測

按照不同納米聚合物氨基和siRNA 磷酸根摩爾比（N/P 比）1、2、4、6、8、10、12 取相應 VA-PEG-PEI溶液與100 nmol/L SCR 混合，常溫下靜止復合30 min。采用納米粒度儀（英國Malvern 公司）測量VA-PEGPEI Zeta 電位和水合粒徑分布，每個樣品測量5 次，取平均值。

1.6 凝膠阻滯電泳試驗

按照不同 N/P 比 0、1、2、4、6、8、10、12 取相應VA-PEG-PEI 和 PEG-PEI 溶液分別與 100 nmol/L SCR 混合，常溫下靜置復合30 min。配制1%瓊脂糖溶液，加入溴化乙錠，終濃度為0.5 μg/mL。 將瓊脂糖溶液倒入凝膠托盤并插入加樣梳，常溫放置30 min后待凝固。 拔出加樣梳，將瓊脂糖凝膠浸沒于盛有TAE 緩沖液的水平電泳槽內，將復合好的不同N/P比VA-PEG-PEI/SCR、PEG-PEI/SCR 樣品分別加入各瓊脂糖凝膠加樣孔內。 接上電源100 V 恒壓電泳30 min，取出凝膠，于 Clinx ChemiScope 6000 型凝膠成像系統（上海勤翔科學儀器公司）觀察電泳siRNA 條帶，并攝片。

1.7 細胞活性試驗

CCK-8 試驗評估不同納米復合物對LX-2 毒性作用：①LX-2 以 5×103個/孔種入 96 孔板內，培養箱中孵育至少12 h 使細胞貼壁；②按N/P=8、6 分別取 VA-PEG-PEI、PEG-PEI 和對照 PEI 與 SCR 復合30 min，96 孔板內每孔加入 100 μL 含不同納米聚合物（VA-PEG-PEI/SCR、PEG-PEI/SCR、PEI/SCR）的DMEM 培養基，濃度梯度設為 10、20、40、80、160、320、640 μg/mL；③孵育 48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，繼續孵育3～4 h；④酶標儀于450 nm、610 nm 檢測各孔光吸收值（A 值），酶標儀軟件自動計算出校正后的A 值，而未添加納米聚合物處理的細胞培養孔設置為對照孔，細胞活性標準化為100%；⑤按以下公式計算細胞活性：細胞存活率＝（加藥孔 A 值-本底孔 A 值）/（對照孔 A 值-本底孔A 值）×100%。 每次試驗均設置 6 個檢測副孔，A 值取6 孔測量平均值。

1.8 細胞轉染效率檢測與細胞內化觀察

通過流式細胞術（FCM）檢測納米載體對HSC siRNA 轉染效率：①將LX-2 和用于對照的肝實質細胞LO-2 分別種于6 孔板內，細胞數量約為2×105個/孔，培養箱中孵育至細胞貼壁；②按N/P=8、6，分別取納米載體VA-PEG-PEI、PEG-PEI 與100 nmol/L SCR-Cy3 復合30 min，另外按不同N/P 分別等于2、4、6、8、10，取相應 VA-PEG-PEI 與 100 nM SCRCy3 復合 30 min；③LX-2 更換分別含 VA-PEG-PEI/SCR-Cy3、PEG-PEI/SCR-Cy3 復合物培養基，于培養箱中孵育5 h，LO-2 更換含VA-PEG-PEI/SCR-Cy3復合物培養基，于培養箱中孵育5 h；④磷酸緩沖液（PBS）沖洗3 次，0.25%胰酶消化、分離細胞，離心并將細胞重懸于600 μL PBS 中。根據Cy3 激發和發射波長分別為550 nm、570 nm，通過流式細胞儀選擇合適通道檢測Cy3 陽性細胞比例，以評估納米復合物對細胞轉染效率，并用隨機操作軟件進行數據分析。

觀察納米載體細胞內化情況：①②③步驟同上；④孵育后，加入4%多聚甲醛固定10 min；⑤加入400 μL DAPI 溶液孵育10 min，對細胞核進行染色；⑥于熒光顯微鏡上觀察、攝片。 上述所有操作過程均在避光條件進行。

1.9 LX-2 TLR4/NF-κB 蛋白表達檢測

蛋白質印跡法（western blot，WB）檢測 LX-2 內TLR4/NF-κB 蛋白表達：①適量 LX-2 接種于 6 孔板內，培養箱中孵育12 h 貼壁；②吸取一定量siTLR4置于Eppendorf（EP）管內，加入相應納米載體VAPEG-PEI（N/P=8）、PEG-PEI（N/P=6）混勻復合 30 min，配制復合物VA-PEG-PEI/siTLR4、PEG-PEI/siTLR4；③更換含上述不同復合物的細胞培養基，siRNA 劑量為100 nM，孵育48 h；④提取各組LX-2 總蛋白，二辛可酸（BCA）蛋白定量，檢測、擬合蛋白含量標準曲線，將樣品蛋白濃度調至一致；⑤按SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配制10%分離膠（電泳電壓為100 V，持續60 min）和濃縮膠（電泳電壓為80 V，持續 20 min）；⑥90 min 后將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于封閉液中封閉1 h，加入1∶1 000 一抗稀釋液于4℃中過夜；⑦加入相應二抗稀釋液于室溫中孵育2 h，ECL 顯影，以 3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參。

1.10 LX2 細胞 α-SMA 表達檢測

免疫熒光化學檢測步驟：無菌圓蓋玻片上分別爬片構建對照組、PEG-PEI 處理組、VA-PEG-PEI處理組的HSC-LX2 細胞，蓋玻片于12 孔板中培養48 h；用4%多聚甲醛固定爬片15 min，體積分數0.5%的Triton X-100 室溫通透20 min；玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；廢棄封閉液，加入1∶1 000 稀釋比的 Alexa Fluor 647 標記的抗 α-SMA抗體100 μL，避光室溫孵育2 h；滴加DAPI 避光孵育5 min，對標本染核；吸水紙吸干爬片上液體，含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像；用Image J 圖像分析軟件分析各組熒光片細胞平均光密度（OD）值，進行統計學分析。

1.11 統計學分析

采用GraphPad Prism 6 統計學軟件分析處理數據，以均數±標準差（）表示，組間比較用單因素方差分析。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

最終合成的聚合物VA-PEG-PEI 通過核磁共振氫譜表征，其1H 波譜圖見圖2。 其中5.37 ppm峰（a）為 VA 雙鍵基團質子特征峰，3.6 ppm 附近的峰（b）為 PEG 特征峰，1.8 ppm 和 1.2 ppm 峰為 PEI特征基團，而7.3 ppm 峰為氘代氯仿的溶劑峰，以三甲基硅烷（TMS）為內標（0 ppm）。 所合成的聚合物VA-PEG-PEI 在其每一個嵌段部分均有標志性特征峰，證明該聚合物成功合成。

圖2 VA 和PEG-PEI 1H 核磁共振波譜圖

圖3 不同N/P 比時靶向納米復合物粒徑和Zeta 電位

納米粒徑分析儀檢測不同N/P 比時VA-PEGPEI/SCR 粒徑分布和Zeta 電位結果顯示，隨著N/P比逐漸增加，復合物粒徑逐漸縮小，N/P 比增大至8時粒徑達最?。?25.0±3.2） nm，而后趨于穩定；Zeta電位隨N/P 比增大逐漸增高，N/P 比為8 時 Zeta 電位為（10.2±1.0） mV，見圖 3。因此，N/P 比為 8 時，復合物具有合適粒徑和弱正電位，有利于細胞攝取、吸收，適合進行后續實驗。

瓊脂糖凝膠阻滯電泳試驗結果顯示，隨著N/P比逐漸增大，siRNA 條帶逐漸減弱，直至消失；VA-PEG-PEI 組、PEG-PEI 組 N/P 比分別為≥8、≥6 時，siRNA 條帶完全消失，說明在siRNA 完全被載體復合；其中VA 靶向修飾后PEG-PEI 復合siRNA 能力較未修飾PEG-PEI 稍有減弱，但仍有良好的siRNA負載能力，見圖4。

圖4 納米復合物在不同N/P 比 凝膠阻滯電泳試驗結果

CCK-8 試驗評估不同納米聚合物對LX-2 活性影響，設置濃度梯度為 10、20、40、80、160、320、640 μg/mL，結果顯示隨著納米聚合物濃度增加，細胞生存活性逐漸下降，其中在高濃度點（＞80 μg/mL）位置的細胞生存率開始明顯下降；VA-PEG-PEI、PEGPEI、對 LX-2 半抑制濃度（IC50）分別為 124.5 μg/mL、93.8 μg/mL，見圖5；表明兩種納米聚合物均有較低的細胞毒性。

圖5 納米聚合物細胞毒性檢測

圖6 不同N/P 比納米聚合物對LX-2 轉染效率

FCM 檢測納米載體對LX-2 轉染效率的結果顯示，N/P=8 時靶向納米聚合物轉染效率最高，隨著N/P 比繼續增大，轉染效率略有下降（圖6），此結果與瓊脂糖凝膠阻滯試驗結果一致；靶向復合物VAPEG-PEI/SCR-Cy3 組、 非靶向復合物 PEG-PEI/SCR-Cy3 組 Cy3 陽性細胞比例分別為（91.5±1.8）%、（55.1±2.1）%（圖 7），靶向納米復合物對 LX-2 轉染效率明顯高于非靶向納米復合物。

熒光顯微鏡觀察納米復合物細胞內化結果顯示，靶向復合物 VA-PEG-PEI/SCR-Cy3 組 LX-2 細胞內紅色熒光斑點數量及強度明顯多（高）于非靶向復合物組和肝實質細胞組（圖8）；該結果與FCM檢測結果一致，再次反映靶向納米載體VA-PEGPEI 對LX-2 具有特異性高效siRNA 輸送功能。

圖7 FCM 檢測納米載體對LX-2 轉染效率

圖8 熒光顯微鏡觀察LX-2 和LO-2 對復合物內化情況（×20）

WB 檢測納米復合物對LX-2 TLR4 基沉默效果顯示，適宜濃度 LPS 刺激 LX-2 后 TLR4、NF-κB表達明顯升高，加入VA-PEG-PEI/siTLR4 或PEGPEI/siTLR4 干預后兩者 TLR4、NF-κB 表達均不同程度下降，VA-PEG-PEI/siTLR4 干預后下降更為明顯（P＜0.01），見圖 9。

免疫熒光檢測顯示，培養48 h 后對照組LX-2高度表達 α-SMA，平均熒光強度為（2.4±0.4）%，LPS刺激處理組平均熒光強度較對照組增高，為（3.5±0.5）%。PEG-PEI/siTLR4 組、VA-PEG-PEI/siTLR4 組HSC α-SMA 表達均較對照組顯著下降，α-SMA 平均熒光強度分別為（1.5±0.4）%、（0.8±0.4）%，與對照組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖10。

3 討論

本研究成功構建了一個能靶向HSC 輸送siTLR4 的基因遞送體系VA-PEG-PEI，該納米載體可將負載siRNA 高效輸送至HSC。 復合siTLR4 后的靶向納米復合物VA-PEG-PEI/siTLR4 可有效抑制HSC TLR4/NF-κB 信號通路表達，從而在體外細胞水平探索肝纖維化治療的可行方法。

TLR4 作為細菌性LPS 受體，是一眾所周知的炎癥誘導劑，是肝損傷和纖維化期間激活HSC 的主要機制［19］。 它可通過 MyD88 依賴性信號通路觸發NF-κB 快速激活，從而上調包括轉化生長因子（TGF）-β 在內的促纖維化細胞因子［6］。 現有大量研究表明，抑制TLR4 信號通路是治療肝纖維化的一個很好策略［20］。 雖然 RNAi 技術是一種調控基因表達有效方法，但由于siRNA 細胞膜穿透能力較差及易被降解［21］，需要一種更加安全高效的體內傳遞體系遞送siRNA。 陽離子聚合物PEI 所帶強正電荷和不可生物降解性，使其具有強烈的生物毒性。 因此，在確定納米載體基本表征和siRNA 復合能力后，需要進一步檢驗對其生物安全性。 只有生物安全性高的納米載體，才具有良好應用前景。 細胞活性試驗可用于評估納米載體生物安全性。 CCK-8 試驗結果顯示，VA-PEG-PEI、PEG-PEI 對 HSC 的 IC50分別為124.5 μg/mL、93.8 μg/mL，說明無論靶向還是非靶向納米聚合物的細胞毒性均很低。 猜測其可能原因，一是在PEI 外部連接不帶電荷的PEG 后，可大為改善聚合物生物相容性和強正電荷特性，從而降低其細胞毒性作用［22］；二是活化的HSC 本身胞質內粗面內質網、高爾基體發達，具有旺盛的蛋白合成能力和較強的抗細胞毒性。

圖 9 納米載體對 LPS 刺激 LX-2 后 TLR4、NF-κB 表達的影響

圖 10 VA-PEG-PEI 和 PEG-PEI 對 LX-2 α-SMA 表達的影響

FCM、WB、免疫熒光檢測結果表明，在體外細胞水平合成的納米載體VA-PEG-PEI 具有靶向HSC高效輸送siRNA 功能，而且在負載了帶沉默基因功能的siTLR4 后，靶向納米復合物VA-PEG-PEI/siTLR4 能有效下調 HSC TLR4/NF-κB 信號通路表達，同時作為HSC 激活標志之一的α-SMA 表達也明顯下調，證明本研究體系在體外細胞水平改善肝纖維化是有效的。

本研究過程中也發現一些不足之處。首先，本研究采用VA 為細胞靶向識別配體，在納米材料細胞轉染效率驗證中雖然證明該納米材料在HSC上高效率轉染，但在其他細胞如肝實質細胞上仍有一定量納米材料被轉染。因此，進一步研究擬可考慮選擇優化納米載體結構及連接多個配體對納米載體進行修飾，以期取得納米載體對目標細胞更加特異性地靶向選擇及更高的療效。其次，本研究迄今僅研究納米基因藥物對肝纖維化過程中TLR4/NF-κB 信號通路表達的影響，而炎癥誘發的肝纖維化發生與進展是一非常復雜的病理生理過程，同時存在多種信號通路共同起作用。 最后，本研究體系迄今僅在體外細胞水平證明改善肝纖維化是有效的。 下一步需將研究延伸至活體動物實驗，探索本研究納米藥物體系在活體水平的治療效果。

綜上所述，本研究通過在納米材料PEI 上修飾VA、 與HSC 表面RBP 受體結合實現靶向效應，同時該納米基因藥物連接PEG 后，生物毒性大幅度降低，血清穩定性明顯提高，而且得益于靶向效應，其藥物用量可明顯降低，這使得本研究體系靶向性納米基因治療肝纖維化可能具有較理想的臨床應用前景。