室內新風空氣凈化系統微生物多樣性研究

殷欣，孟藝偉，趙麗婭，齊君，夏雪奎，高翠玲

(1. 齊魯工業大學(山東省科學院)山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250103; 2. 山東省產品質量檢驗研究院，山東 濟南 250102)

室內空氣環境質量與城市人群健康密切相關。成年人約80%～90%的時間是在室內度過的，而在城市中一些行動不便的老人、嬰兒等在室內的時間可能高達95%[1]。室內空氣若發生微生物污染，易引起人們(特別是免疫力低下的老人和嬰幼兒)出現頭疼、呼吸道感染[2]、惡心、過敏、皮炎等癥狀。形成室內空氣細菌污染的原因一般是通風不好，并且室內人員較多，更容易滋生致病微生物。此外，室內通風系統的微生物污染也是導致室內微生物超標的重要原因[3]。因此，研究室內空氣的微生物群落結構變化將對人們的身體健康起到警示和保障作用。

傳統的微生物鑒定方法，主要通過將微生物培養后依據形態學、生理生化反應、生態學特征等進行鑒別。Orji等[4]指出這種方法只能檢測出約1%的重要病原菌，而利用宏基因組學、高通量測序、系統發育樹分析等技術，自然界中100%的致病菌都能得到研究。隨著基因測序技術的發展，16S rDNA擴增子測序技術的應用越來越廣泛，已成為研究大氣、水、油井等環境樣品中細菌群落結構的重要手段[5-7]。

隨著人們對空氣質量與健康關系認識地不斷加深，如何將室內空氣中的雜質去除以提高空氣質量也受到研究者的關注。Zhao等[8]通過多級過濾去除了室內空氣中大量的灰塵、微生物等雜質，從而提高了空氣質量。近年來，國內越來越多的新風空氣凈化系統進入到各種場所，如商場、醫院、幼兒園、家庭等。然而新風系統的興起時間較短，人們對于該系統的認識還不夠全面，例如是否能夠高效凈化空氣，保障室內空氣的持續高質量而不引發空氣的二次污染等。目前針對室內新風空氣凈化系統，利用測序技術對其微生物群落結構進行研究，從而探討室內空氣的微生物群落結構變化的相關文獻還未見報道。本文收集了在濟南歷城地區使用的新風系統空氣濾膜所積累的微生物為樣本，利用16S rDNA擴增子測序技術進行細菌豐度檢測，以期掌握該地區室內細菌的主要組成成分，并分析潛在的細菌污染風險。

1 材料與方法

1.1 材料

濟南市歷城區某全國連鎖幼兒園，截至2018年11月31日使用了不同時間的新風系統中的超細玻璃纖維空氣濾膜，分為3個樣本組，每個樣本組含有3個重復樣本(表1)。所有樣本裝入無菌采樣袋中，在4 ℃條件下運輸至實驗室，4 h內處理。

表1 不同使用時間的空氣濾膜樣本編號Table 1 Numbers of air-filtration membrane samples used in different time

1.2 樣本處理

(1)每個樣本取15～20片空氣濾膜剪碎，分裝入含有0.9%生理鹽水的50 mL無菌離心管中，4 ℃，200 g離心2 h；(2)輕輕渦旋，用0.22 μm MCE微孔濾膜(貨號：F513134-0001-生工)過濾；(3)收集微孔濾膜，剪碎后用于提取樣本的宏基因組DNA。DNA提取采用DNeasy Power Soil Kit(貨號：12888-50-QIAGEN)。

1.3 16S rDNA擴增子測序

各樣本的宏基因組DNA用無菌水稀釋至終濃度1 ng/μL，并以此為模板，利用16S V3-V4區通用引物(F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進行PCR擴增[9]。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒(Thermofisher公司)構建宏基因組文庫，經過定量和檢測后進行高通量測序，測序方法為單端測序(single-end)法。

1.4 測序數據處理

使用Cutadapt v1.9.1先對reads進行初步處理得到原始數據(raw reads)，然后進行去除嵌合體序列的處理，得到有效數據(clean reads)。利用Uparse v7.0.1001對所有樣品的全部有效數據進行聚類，默認以97%的一致性(identity)將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)，同時會選取OTU的代表性序列，依據其算法原則，篩選OTU中出現頻數最高的序列作為代表序列；對OTU序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132[10]的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1.0)，獲得分類學信息并分別在各個分類水平：kingdom(界)，phylum(門)，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)統計各樣本的群落組成；使用MUSCLE v3.8.31軟件進行快速多序列比對，得到所有OTU序列的系統發生關系[11]。最后對各樣品的數據進行均一化處理，后續分析都是基于均一化處理后的數據。

2 結果與討論

2.1 測序數據分析

16S rDNA擴增子測序得到的有效數據數目在45 878～64 178范圍內，平均長度395～415 nt，有效數據中堿基質量值大于20(測序錯誤率小于1%)的堿基所占的百分比(Q20)超過82%，數據得率90%以上。3個樣本組的測序深度均超過99.9%，理論上測序數據已覆蓋樣本中的全部序列。

2.2 OTUs聚類分析

在97%相似性水平上進行聚類，3個樣本組共有OTU數量達1015個，樣本組JN6，JN9和JN12特有的OTU數量分別為303，484和274個(圖1)。基于OTU的物種分類分析，細菌種類覆蓋31個門725個屬。其中，樣本組JN9中特有的OTU數目最多，預示含有較多的特有微生物種類。

圖1 OTU維恩圖Fig.1 Venn diagram of OTU

2.3 門水平Top10物種相對豐度及優勢物種差異分析

對OTU的代表序列進行物種注釋，根據物種注釋結果，選取3個樣本組在門(phylum)分類水平上最大豐度排名前10的物種進行物種相對豐度和優勢物種差異分析(圖2)，結果顯示各樣本中以變形菌門(Proteobacteria)(占比27%～54%)、厚壁菌門(Firmicutes)(占比13%～30%)、放線菌門(Actinobacteria)(占比12%～30%)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(占比4%～10%)的微生物居多，4種細菌門總豐度平均為90%。許多對人體有害的微生物如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌、結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌等都屬于這些種類[12-13]。在生活環境中，變形菌門細菌比較常見，即使經過消毒殺菌，其再生能力仍然較強[14]。厚壁菌門細菌即使處于一些抗生素環境中也具有較強的生命力[15]。放線菌中絕大多數是有益菌，也有極少數會引起人類的疾病。擬桿菌門的一些細菌可以釋放細胞神經毒素從而使人體發生炎癥性神經變性，甚至已經可以作為某些環境下的污染指標[16-17]。隨著使用時間的增加，3個樣本組中變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門這4類菌之間的豐度比例相對變化不明顯，但總豐度由85%上升至95%，分析可能是該地區空氣中微生物群落結構長期變化不大，且持續污染程度較嚴重，使得空氣中微生物含量豐富導致的這種現象，所以該地區室內新風空氣凈化系統濾膜中致病菌存在的可能性較大，可能會出現微生物的二次污染情況。

圖2 門水平上Top10物種相對豐度柱形圖Fig. 2 Bar chart of relative abundance of top 10 species at phylum level

2.4 屬水平Top100物種系統進化關系及Top10物種相對豐度分析

變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門中所含菌屬種類明顯居多(圖3)。在3個樣本組中，甲基桿菌屬(Methylobacterium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、副球菌屬(Paracoccus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、萊茵海默氏菌屬(Rheinheimera)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和藍細菌屬等為優勢菌屬(圖3)。其中，甲基桿菌屬、雙歧桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、不確定藍細菌屬的微生物一般是室內經常檢出的優勢菌群[18]。此外，樣本組JN12中還特別富含萊茵海默氏菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)和不動桿菌屬的微生物(圖4)。其中不動桿菌屬中一些微生物是條件致病菌，如鮑曼不動桿菌，該菌是臨床上最常見的一種條件致病菌，通常會引起腹膜炎、骨髓炎、關節炎、菌血癥和肺炎等[19]。Wu等[20]利用16S rDNA高通量測序技術對奶粉生產線室內空氣進行了微生物多樣性檢測，也發現鮑曼不動桿菌、蠟樣芽胞桿菌、科氏葡萄球菌等一些致病菌。由于JN12中不動桿菌屬微生物占有較高的豐度，因此推測該地區的空氣凈化系統在使用12個月時存在微生物二次污染的風險，應當引起居民的注意。

圖3 屬水平上Top10物種相對豐度柱形圖Fig. 3 Bar chart of relative abundance of top10 species at genus level

分支和扇形的顏色表示其對應的門；扇環外側的堆積柱形圖表示該菌屬在不同樣本中的豐度分布信息。圖4 屬水平Top100物種系統發生關系Fig.4 Top100 species phylogenetic relationships at genus level

2.5 不同使用時間對優勢物種的影響

通過分析3組樣本組之間的優勢菌屬和種的差異(圖5)，我們在屬和種分類水平下，選取平均豐度排名前10的物種，生成三元相圖(ternary plot)。由圖5(a)可知，隨著空氣濾膜使用時間的延長，微生物的菌屬優勢也在發生變化，逐漸由不確定藍細菌屬、雙歧桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬向芽孢桿菌屬、副球菌屬過渡，最后不動桿菌屬和萊茵海默氏菌屬微生物占絕對優勢。在種水平上(圖5(b))，從使用時間6個月到12個月，由Loliumperenne，Methylobacteriumaquaticum，Bambusaoldhamii和Pelomonaspuraquae向Sphingomonasphyllosphaerae，Bifidobacteriumadolescentis，Moraxellaosloensis，Clostridiumpapyrosolvens和Kocuriarosea過渡，最后Acinetobacterjohnsonii占絕對優勢。其中，使用時間為9個月的樣本中含有奧斯陸莫拉氏菌(Moraxellaosloensis)。該菌為條件致病菌，可引起臨床上原發性和繼發性感染，如結膜炎、中耳炎、腦膜炎、腎炎、支氣管炎和關節炎等[12,21]。以上結果預示著該地區的室內空氣中存在著一些致病菌，通過新風空氣凈化系統過濾后累積于濾膜上，若濾膜的使用時間過長，容易發生微生物二次污染，影響居民的身體健康。

圖5 樣本的優勢屬和種的差異Fig. 5 Differences of dominan tgenus and species in samples

3 結論

采用高通量測序技術對樣本16S rDNA片段進行測序，可以獲得準確的序列信息和更大的數據量，從而在后續分析中獲得更加深入、全面和可靠的結果。將此技術引入室內空氣凈化系統的細菌多樣性分析中，可以提供更加詳實準確的信息。通過分析濟南市歷城地區室內新風凈化系統隨著使用時間的延長室內空氣中微生物群落結構的變化，發現該地區室內空氣中微生物含量較豐富，群落結構長期變化不大，并且空氣中存在條件致病菌，如奧斯陸莫拉氏菌等。該地區室內新風空氣凈化系統使用12個月時存在一定的微生物二次污染風險。