IL-1β經NK-kB通路對牙周膜干細胞成骨成分調控的機制研究

李群 周純香

[摘要]目的：探討IL-1β經NK-kB通路對炎癥狀態下牙周膜干細胞成骨成分調控機制。方法：從正常牙周組織和慢性牙周炎組織采用組織消化和有限稀釋法獲取不同來源的人牙周膜干細胞（hPDLSCs），采用免疫細胞化學法和流式細胞儀檢測兩種源細胞表面標志分子表達，采用MTT和細胞周期檢測間充質干細胞增殖能力;間充質干細胞多向分化能力檢測采用成骨和成脂分化誘導。構建IL-1β（l0ng/ml）模擬牙周炎癥微環境模型，加入NF-kB信號通路抑制劑BAY 11-7082，研究牙周膜干細胞缺失性功能研究。結果：體外有限稀釋法結果表明，兩種來源間充質干細胞均具有自我更新能力，MTT和細胞周期檢測表明牙周炎組干細胞增殖能力優于對照組，炎癥因子IL-1β處理的正常組牙周膜干細胞可激活NF-kB通路，在IL-1β處理同時加入BAY 11-7082后成骨有關基因及蛋白表達水平增加。結論：炎癥因子IL-1β可激活NF-kB信號通路，并且可抑制牙周膜干細胞向成骨分化;對NF-kB信號通路抑制后能夠明顯逆轉IL-1β導致的干細胞成骨分化能力降低。

[關鍵詞]IL-1β;NK-kB通路;牙周膜干細胞;炎癥微環境;成骨分化

[中圖分類號]R780.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）09-0095-05

Analysis of the Regulation Mechanism of IL-1β on Osteogenesis of Periodontal Ligament Stem Cells Via NK-kB Pathway

LI Qun1， ZHOU Chun-xiang2

（1.Department of Stomatology，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410007，Hunan，China;2.Department of Stomatology，Yongzhou Central Hospital，Yongzhou 425000，Hunan，China）

Abstract： Objective? To investigate the regulation mechanism of IL-1β on the osteogenesis of periodontal ligament stem cells in inflammatory state by NK-kB pathway. Methods? Human periodontal ligament stem cells （hPDLSCs） from different periodontal tissues and chronic periodontitis tissues were obtained by tissue digestion and limiting dilution method. The expression of cell surface marker molecules was detected by immunocytochemistry and flow cytometry. At the level， the proliferation of mesenchymal stem cells was detected by MTT and cell cycle; the multi-directional differentiation ability of mesenchymal stem cells was induced by osteogenic and adipogenic differentiation. Subsequently， IL-1β （10ng/ml） was used to simulate the periodontal inflammatory microenvironment and the NF-kB signaling pathway inhibitor BAY 11-7082 was added to study the function of periodontal ligament stem cell deletion. Results? In vitro limiting dilution method showed that both mesenchymal stem cells had self-renewal ability. MTT and cell cycle assay showed that the proliferative ability of stem cells in periodontitis group was better than that in control group， and the normal group of periodontal ligament stem cells treated with inflammatory factor IL-1β. The NF-kB pathway can be activated， and the expression levels of osteogenic genes and proteins are increased after the addition of BAY 11-7082 to IL-1β treatment. Conclusion The inflammatory factor IL-1β can significantly activate the NF-kB signaling pathway and negatively regulate the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells. Inhibition of NF-kB can effectively reverse the decline in osteogenic differentiation induced by IL-1β.

Key words： IL-1β; NK-kB pathway; periodontal ligament stem cells; inflammatory microenvironment; osteogenic differentiation

牙周病可引起牙周頜骨及結締組織萎縮缺損，缺損處骨骼及軟組織重建為近年口腔科研究的熱點。Seo等[1]在2004年由健康牙周組織體外培養分離出牙周膜干細胞。隨后Osawa[2]和Cetinkaya B[3]等研究證實炎癥牙周組織和牙髓中存在有關的干細胞存在。因此，牙周組織有關干細胞在牙周缺損修復中具有重要意義，且炎癥有關因子在干細胞修改作用中具有調節功能。炎癥對干細胞微環境穩態具有破壞作用，對干細胞內源性信號調控作用可能具有一定的影響[4]。因此，牙周炎導致的牙周結締組織萎縮可能與人牙周膜干細胞（Human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）生物學功能受炎癥因子影響相關。NK-кB在慢性牙周炎發展中為一個具有關鍵性炎癥調控者的作用，NK-кB信號通路激活可促進TNF-α、IL-1β等炎癥因子的表達，這些炎癥因子作為激動劑可進一步作用于NK-кB信號通路，增加該信號通路的活性[5]。基于上述相關報道，本研究探討PDLSCs在炎癥狀態下NK-кB和IкB表達水平的變化以及Nk-KB信號通路對炎癥狀態下PDLSCs成骨分化的調控機制，以期為臨床治療慢性牙周炎提供一定的依據。

1? 資料和方法

1.1 主要試劑：抗STRO-1抗體（購自美國R&D Systems公司），羊抗鼠熒光二抗（購自中國Boster公司），ALP顯色試劑（購自中國Beyotime公司），TRIzol Reagent（購自美國Invitrogen公司），Real-time PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒（購自日本TaKaRa公司），抗人Runx2、β-actin抗體（購自美國Abcam公司），鼠抗人二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠/抗兔IgG（購自中國博士德公司），IкBa抗體、β-IкBa抗體、HDAC-1抗體、BAY 11-7082（購自美國Cell signaling公司），細胞核蛋白與胞漿蛋白抽提試劑盒（購自美國Millipore公司）。

1.2 樣本收集：正常組樣本來源于筆者醫院口腔科門診正畸患者10例，年齡23～35歲;炎癥組樣本來源于筆者醫院口腔科門診治療的慢性牙周炎患者8例，年齡24～37歲。

1.3 實驗方法

1.3.1 干細胞原代培養和克隆：取兩組牙周組織進行細胞原代培養，然后采用有限稀釋法克隆培養牙周膜干細胞。本研究采用第3～4代多克隆干細胞。

1.3.2 干細胞表型分析

1.3.2.1 細胞免疫熒光法：取兩組處于對數生長期的第3代細胞，用細胞免疫熒光法分析干細胞表面分子表達水平，陰性對照為PBS。

1.3.2.2 流式細胞儀分析：取兩組處于對數生長期的第3代細胞（1×106個/ml），用流式細胞儀檢測熒光表達率。研究組細胞加入FITC、PE小鼠抗人CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146抗體，陰性對照加入FITC、PE標記的小鼠IgG。

1.3.2.3 MTT和周期分析：取兩組處于對數生長期的第3代細胞，運用MTT法繪制生長曲線。并取兩組處于對數生長期的第3代細胞，處理后4℃保存以備進行周期分析。

1.3.2.4 干細胞誘導分化實驗：取兩組處于對數生長期的第3代細胞，分別進行成骨誘導和成脂誘導，并進行礦化結節定量分析和脂滴定量分析。

1.3.3 Real-time RT-PCR檢測和Western blot檢測：按照TRIZOL Reagent說明書提取干細胞RNA，并測定純度，然后按照PrimeScriptTM RT-PCR kit試劑盒說明合成cDNA，計算反轉錄體系所需RNA量。按照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明將反轉錄獲得的cDNA加入擴增體系，置于CFX96TM Real-time System檢測。并對兩種經成骨誘導干細胞蛋白用Western blot進行檢測。

1.4 NF-кB信號通路研究：取正常組處于對數生長期的第4代細胞分為對照組和誘導組。對照組采用成骨誘導液培養7d，誘導組使用含有IL-1β（10ng/ml）的成骨誘導液培養7d。棄培養基加入新鮮培養基培養1h后提取細胞RNA和胞質/胞核蛋白，用Real-time RT-PCR和Western blot進行檢測。

1.5 統計學分析：采用SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析;組間對比采用t檢驗分析，當P<0.05時差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 兩種來源PDLSCs細胞形態學觀察：對組織行原代培養3～8d后可見牙周膜組織塊邊緣存在牙周膜細胞爬出（見圖1A、D），大多數細胞鏡下形態為長梭形或不規則形。采用有限稀釋法克隆培養干細胞8d即可出現細胞克隆，獲得正常組PDLSCs（見圖1B）和炎癥組PDLSCs（見圖1E）。倒置顯微鏡觀察，可見兩種來源細胞呈紡錘形（見圖1C、F）。兩種來源PDLSCs形態學無差異。

2.2 兩種來源PDLSCs細胞表型：兩種來源PDLSCs細胞行熒光化學分析顯示均表達Seto-1（見圖2）。經流式細胞儀分析顯示，兩種來源細胞均表達CD29、CD44、CD90、CD105、CD146，但未表達CD14、CD31及CD45（見圖3）。

2.3 兩種來源PDLSCs細胞增殖能力比較：細胞周期檢測結果表明，正常組PDLSCs細胞G2+S期約占20.4%，炎癥組為36.1%;連續7d MTT檢測結果表明，兩種來源干細胞在培養第3天進入對數生長期，第4～5天為增殖期，第6天為平臺期，對數生長期開始兩種來源PDLSCs細胞增殖能力存在差異性。見圖4。

2.4 兩種來源PDLSCs分化能力對比：對兩種來源PDLSCs進行成骨誘導7d，行ALP染色結果顯示，正常組PDLSCs染色較炎癥組深，茜素紅染色結果顯示，正常組PDLSCs礦化結節較炎癥組多;ALP定量與礦化結節定量分析表明正常組PDLSCs分化能力高于炎癥組（見圖5）;Real-time PCR檢測表明，正常組PDLSCs的Runx2、ALP、OCN及Osterix mRNA表達高于炎癥組（見圖6）;Western blot檢測結果表明，正常組PDLSCs Runx2和Osterix蛋白表達水平高于炎癥組。對兩種來源PDLSCs進行成脂誘導14d，采用油紅O染色后結果顯示，兩組細胞脂滴形態無差別，但正常組PDLSCs脂滴數量及體積大于炎癥組;Real-time和Western blot結果表明，成脂誘導7d正常組PPAR-γ基因和蛋白表達較炎癥組高。

2.5 炎癥組PDLSCs成骨分化過程NF-кB信號通路激活增強：Western blot檢測結果表明，隨成骨誘導時間延長，Runx2蛋白表達水平隨之增加，且正常組PDLSCs Runx2蛋白表達水平高于炎癥組;兩種來源PDLSCs成骨誘導時p65和p-IкBα蛋白表達增加，而炎癥組PDLSCs胞質p65和胞核p-IкBα蛋白表達水平高于正常組，見圖7。

2.6 阻斷NF-кB信號通路可促進hPDLSCs成骨分化：Western blot檢測結果表明，加入BAY 11-7082可抑制hPDLSCs胞質中p65和IкBα蛋白表達，且胞核中p65表達也有所降低。見圖8。

2.7 IL-1β體外模擬炎癥微環境對PDLSCs成骨分化能力的影響：ALP、茜素紅及定量結果表明，IL-1β組ALP和茜素紅著色與對照組相比較淺，定量結果則一致（見圖9A～B）。Real-time RT-PCR檢測表明，成骨誘導7d，干預組Runx2和Osterix基因表達較對照組降低（見圖9C～D）;Western blot檢測結果表明，IL-1β組Runx2和Osterix蛋白表達較對照組低。

2.8 IL-1β對PDLSCs的NF-кB通路影響：IL-1β組胞質中p65和IкBα蛋白表達水平降低，但磷酸化IкBα水平上升;胞核內p65表達水平與對照組對比增加（見圖10）。

3? 討論

目前，大量研究發現PDLSCs在牙周組織再生中具有重要作用[6-7]，而在慢性炎癥中，牙周組織缺損與再生異常可能是因為PDLSCs功能異常導致[8]。本研究收集牙周健康患者和牙周炎患者牙周膜，采用有限稀釋法進行離體培養。實驗結果表明，兩種不同來源PDLSCs細胞形態呈紡錘形，并且已螺旋簇集落生長，在形態學上無差異。則證實PDLSCs形態與炎癥無相關性，與有研究結果相符。目前，間充質干細胞表面標志物鑒定為細胞鑒定的主要方式，PDLSCs為間充質干細胞的一種，與其他間充質干細胞表面標志物表達無差異，可特異性的表達Stro-1等分子標記物[9]。兩種來源PDLSCs表面標志物表達無差異，但炎癥組PDLSCs克隆形成率更高，則證實微環境改變對PDLSCs增殖能力具有調節作用。為了驗證上述結果，本研究采用流式細胞儀檢測細胞周期與MTT檢測細胞增殖能力，研究結果表明炎癥組PDLSCs細胞增殖能力高于正常組。因此，可推測PDLSCs受到炎癥因子刺激后發生功能性缺陷，但細胞通過增強自我增殖能力達到功能性代償的作用。當然，也可能因炎癥作用促進PDLSCs增殖，但尚需進一步的研究證實。對兩種來源PDLSCs細胞進行成骨成脂誘導，兩種來源PDLSCs細胞礦化結節和脂滴出現，由此證實兩種來源PDLSCs均具有多向分化能力，但炎癥組PDLSCs成骨與成脂分化能力較弱。成骨分化過程中，ALP活性越高表明細胞向成骨方向分化的程度越高，分泌礦化基質的能力也越高。Runx2和Osterix為干細胞中重要的轉錄因子，Runx2和Osterix表達水平為成骨分化能力的反應指標。PDLSCs成骨誘導分化7d ALP染色和誘導21d茜素紅染色表明，正常組PDLSCs礦化能力高于炎癥組。除此之外，PDLSCs成骨誘導后，正常組PDLSCs成骨有關基因Runx2和Osterix表達水平與炎癥組相比較高。上述研究結果證實牙周炎來源PDLSCs成骨能力受損。對PDLSCs進行成脂誘導14d，行油紅O染色證實正常組PDLSCs脂滴數量與炎癥組相比更多。成脂有關基因PPAR-γ在炎癥組PDLSCs表達水平低于正常組PDLSCs。上述研究證實炎癥組PDLSCs成脂分化能力較弱。

轉錄因子NF-кB在炎癥和免疫應答中具有重要的作用[10-11]。對關節炎進行研究發現，采用特異性抑制劑IKK可抑制破骨細胞形成緩解炎癥導致的骨喪失，則表明NF-кB在炎性骨疾病中具有重要作用[12]。雖然NF-кB在破骨細胞形成中作用已證實，但NF-кB在成骨細胞活性、骨形成等的作用研究較少。在本研究中，采用IкBα抑制劑BAY 11-7082能夠特異性阻斷NF-кB信號通路，可增正常組PDLSCs細胞增殖能力且對炎癥組PDLSCs增殖能力也有一定的促進作用。說明在炎癥條件下NF-кB信號通路被激活，進而引起PDLSCs成骨分化能力降低。

慢性牙周炎患者齦溝液中的炎性因子水平高于正常人群，而牙周炎中主要的炎癥因子之一為IL-1β[13]。IL-1β可持續活化NF-кB，活化后可加重局部組織炎癥反應，且能夠通過各種信號通路抑制炎癥組PDLSCs向成骨分化。在NF-кB經典信號通路中，活化的IKK磷酸化IкB特異性絲氨酸殘基使IкB磷酸化被降解。IкB被降解后，轉錄因子NF-кB可由蛋白復合體中釋放，并且由胞質轉移至胞核，與DNA上的кB位點結合，活化NF-кB信號通路下游基因[14]。雖然，IL-1β調節作用較為復雜，且作用機制尚未明確，但可以肯定IL-1β促炎效果則主要為通過持續激活NF-кB發揮作用[15]。在本研究中，IL-1β處理的正常組PDLSCs成骨分化能力明顯降低，且p-IкBα及核內p65表達水平升高，說明IL-1β可抑制PDLSCs成骨分化可能是通過NF-кB通路介導發揮作用。這與葉煒等研究結果相似[16]。在PDLSCs細胞中加入IL-1β和BAY 11-7082可使炎癥組PDLSCs成骨分化能力有所恢復。證實NF-кB具有介導IL-1β對PDLSCs成骨分化的調節作用。

綜上所述，炎癥因子IL-1β可激活NF-kB信號通路，并且可抑制牙周膜干細胞向成骨分化;對NF-kB信號通路抑制后能夠明顯逆轉IL-1β導致的干細胞成骨分化能力降低。

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[收稿日期]2019-12-23

本文引用格式：李群，周純香.IL-1β經NK-kB通路對牙周膜干細胞成骨成分調控的機制研究[J].中國美容醫學，2020，29（9）：95-99.