基于轉錄組測序的木薯性別決定相關基因挖掘

韋麗君　俞奔馳　宋恩亮　鄭華　盧賽清　付海天

摘要：【目的】明確木薯不同性型花的轉錄組差異，為深入研究木薯多開雌花和兩性花及協調木薯性別比例提供理論參考。【方法】以木薯雄蕾、雌蕾和兩性蕾為供試材料，采用Illumina HiSeqTM 4000測序平臺對其進行轉錄組測序，通過生物信息學對轉錄本進行比較分析，預測和篩選出木薯性別決定相關基因。【結果】通過轉錄組分析獲得高質量序列（Clean reads）64189053個，高質量堿基19.29 Gb。3種花蕾的GC含量均在43.00%左右、Q30均在95.00%左右。木薯雄蕾、雌蕾和兩性蕾的Clean reads總數分別為42642272、42172402和43563432條，其中，參考基因組和單端的比對率均在77.00%左右、多位置比對率均小于0.80%，正、負鏈比對率均在39.00%左右;約有90.00%的序列定位于外顯子，僅有5.00%的序列定位于內含子或基因間區。在雄蕾—雌蕾（前者是對照，后者是處理，下同）、雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾3個對比組中分別篩選到3629、2499和2492個差異表達基因（DEGs），注釋到GO功能數據庫中的DEGs分別為2544、1749和1807個，其中，雄蕾—雌蕾對比組的上調表達基因和下調表達基因數量均最多。以富集于生物學過程（主要為代謝過程和細胞過程）的DEGs最多，其次是分子功能（主要為結合和催化）和細胞組分（主要為細胞和細胞部分）;無論是注釋到GO功能數據庫的DEGs，還是注釋到生物學過程、細胞部分和分子功能等主要次級分類中的DEGs，均以雄蕾—雌蕾對比組最多。3個對比組中均以參與激素信號傳導的DEGs最多;且又以富集于一般功能預測的DEGs最多，其次是富集于轉錄的DEGs，富集于復制、重組和修復及信號傳導機制的DEGs也較多，但雄蕾—雌蕾對比組大部分GOG功能類別的DEGs明顯多于雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾對比組，而雄蕾—兩性蕾與雌蕾—兩性蕾對比組間差異不明顯。3個對比組的DEGs富集于50條KEGG信號通路，其中以富集于植物激素信號傳導的DEGs最多，共篩選獲得88個與激素信號轉導相關的DEGs，其中log2FC>3的基因有26個，且大多數為生長素相關的基因。木薯雄蕾、雌蕾和兩性蕾間差異表達的轉錄因子基因有196個，log2FC>3的轉錄因子基因有87個，主要為ERF、bHLH、WRKY和MYB四大類轉錄因子基因。【結論】木薯不同性型花存在較多的DEGs，其中與生長素及ERF、bHLH、WRKY和MYB轉錄因子相關的基因均與木薯性別決定密切相關，可能是木薯性別分化的關鍵調控基因。

關鍵詞： 木薯;性別決定;基因挖掘;差異表達基因（DEGs）;激素信號傳導;轉錄組測序

中圖分類號： S533.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1785-12

Gene mining for sex determination in cassava（Manihot esculenta Crantz） based on transcriptome sequencing

WEI Li-jun， YU Ben-chi*， SONG En-liang， ZHENG Hua， LU Sai-qing， FU Hai-tian

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】Transcriptome difference of cassava flowers with different sex-types were studied to provide theoretical basis for cassava developing more female flowers and bisexual flowers， and further for controlling the proportion of cassava flowers sex. 【Method】The transcriptome of male buds，female buds and bisexual buds from cassava were sequenced with Illumina HiSeqTM 4000 platform. Comparative analysis of transcription through bioinformatics was performed to predict and screen for the genes involved in cassava sex determination. 【Result】The results showed that a total of 64189053 clean reads and 19.20 Gb clean bases were obtained，the GC content of the three buds were about 43.00% and the Q30 were about 95.00%. For male buds， female buds and bisexual buds， total clean reads were 42642272， 42172402 and 43563432， respectively. The proportion of reference genome， unique mapped reads， multiple mapped reads， reads Map to “+”， and reads Map to “-” were 77.00%， 77.00%， less than 0.80%， 39.00% and 39.00%， respectively. About 90.00% of the reads were identified in exon， and about 5.00% were identified in intron or gene interval. Differential expression analysis showed that 3629，2499 and 2492 differentially expressed genes（DEGs） were successively found in male buds-female buds（M-F）， male buds-bisexual buds（M-B） and female buds-bisexual buds（F-B）（the former one was control， the latter was treatment）， in which， 2544， 1749 and 1807 DEGs were annotated to GO function database， respectively. The down-regulated and up-regulated genes were the most in the M-F group among the three comparisons. The DEGs were mainly involved in biological processes（mainly metabolic process and cell process）， and secondly involved in molecular functions （mainly binding and catalysis） and cellular component（cell and cell part）. The quantities of DEGs annotated to GO database， or annotated to the biological process， cellular component or molecular function in the M-F were higher than those in the other comparisons. For all comparisons， the quantities of DEGs involved in hormone sig-naling transduction were always the most among all KEGG pathway. The main functions involved in DEGs were generally functional prediction，followed by transcription， replication， recombination and repair， and signaling transduction mechanisms， in which， the quantities for M-F exceeded those for the M-B and the F-B. And the DEGs were not significantly different between the latter two treatments. In all treatments， a signal transduction mechanisms. DEGs were enriched in 50 KEGG signaling pathways，including the largest number of plant hormone signal transduction. Through further screening， a total of 88 hormone-related genes were obtained， including 26 genes with log2FC>3， and the most involved in auxin. A total of 196 transcription factors were obtained，including 87 genes with log2FC>3，and mainly involved in ERF， WRKY， bHLH and MYB. 【Conclusion】There are many differentially expressed genes in different sex-types flowers in cassava. Auxin， ERF，WRKY，bHLH and MYB transcription factor related genes are closely related to sex determination of ca-ssava， they may be the key regulatory factors of cassava sex determination.

1. 4 數據分析

原始測序數據（Raw data）以FASTQ格式保存，經匹配及過濾低質量堿基后得到高質量序列（Clean reads），再與參考基因組比對得到比對序列（Mapped reads）。從NCBI數據庫搜索下載參考基因組。然后通過比對效率（Mapped ratio）和Clean reads在參考基因組上的分布情況判定比對結果是否合格，合格的Clean reads可用于后續的生物信息學分析。

1. 5 差異表達基因（DEGs）篩選

應用Cufflinks中的Cuffquant和Cuffnorm組件，結合Mapped reads在基因組上的位置信息定量轉錄本及基因表達水平。采用FPKM（Fragments per kilobase per million mapped reads）表示轉錄本或基因表達水平，并以Benjamini-Hochberg校正p值（p-value）。以表達差異倍數（Fold change，FC）結合錯誤發生率（False discovery rate，FDR）篩選DEGs，即以FC≥2且FDR≤0.01為標準，利用EBseq進行差異表達基因分析（Leng et al.，2013），篩選出log2FC>3的差異表達顯著基因。

1. 6 統計分析

采用Excel 2010統計試驗數據，繪制DEGs數量柱形圖及其COG分類圖;利用topGO繪制DEGs的GO功能富集圖;并以KOBAS繪制DEGs顯著富集的KEGG信號通路富集圖。

2 結果與分析

2. 1 木薯花蕾測序數據及質量分析結果

Raw data經過濾去雜后，共得到64189053條Clean reads，高質量堿基19.29 Gb，每個樣品的高質量堿基均在6.30 Gb以上。3種花蕾的GC含量均在43.00%左右、Q30均在95.00%左右（表1），表明測序質量良好。將測序數據與參考基因組序列進行比對，結果如表2所示。木薯雄蕾、雌蕾和兩性蕾對比到參考基因組上的Clean reads分別為42642272、42172402和43563432條，其中，參考基因組和單端的比對率均在77.00%左右、多位置比對率均小于0.80%，正、負鏈比對率均在39.00%左右，表明試驗污染少、測序數據質量較好。從比對序列分布情況看，約有90.00%序列定位于外顯子，僅有5.00%左右的序列定位于內含子和基因間區。序列比對到內含子和基因間區分別是由于mRNA前體、發生可變剪切的內含子保留或基因組注釋不完善所致。

2. 2 木薯不同花蕾間的DEGs分析結果

根據DEGs篩選標準，在雄蕾—雌蕾（前者是對照，后者是處理，下同）、雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾3個對比組中篩選到的DEGs分別為3629、2499和2492個（圖1），其中上調表達基因分別為2290、1718和1340個，下調表達基因分別為1339、781和1152個，即雄蕾—雌蕾對比組中上調表達和下調表達的基因數量均最多。雄蕾—兩性蕾對比組上調表達和下調表達的基因數量差異最大，上調表達基因數量是下調表達基因數量的2.20倍，其次為雄蕾—雌蕾對比組，上調表達基因數量是下調表達基因數量的1.71倍，表明雄蕾—兩性蕾和雄蕾—雌蕾對比組的DEGs以上調表達為主、下調表達為輔。

2. 2. 1 DEGs的GO功能富集分析結果 雄蕾—雌蕾、雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾3個對比組注釋到GO功能數據庫中的DEGs分別為2544、1749和1807個。對DEGs的GO功能進行富集分析，結果（圖2）顯示，3個對比組均以富集于生物學過程的DEGs最多，其次為分子功能，以富集于細胞組分的DEGs最少。在生物學過程方面，雄蕾—雌蕾、雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾3個對比組均以富集于代謝過程的DEGs最多，分別為1577、1087和1148個，其次為細胞過程，分別為1348、932和946個，富集于單細胞過程的DEGs數量也較多，分別為1302、935和946個。在細胞組分方面，雄蕾—雌蕾、雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾3個對比組均以富集于細胞和細胞部分的DEGs較多，其中，富集于細胞的DEGs分別為994、716和699個，富集于細胞部分的DEGs分別為999、720和703個;富集于細胞器的DEGs也較多，分別為672、485和471個。在分子功能方面，雄蕾—雌蕾、雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾3個對比組均以富集于催化活性和結合的DEGs較多，其中富集于催化活性的DEGs分別為1373、954和1002個，富集于結合的DEGs分別為1369、946和940個。可見，在GO功能富集分析中，無論是注釋到GO功能數據庫的DEGs，還是注釋到生物學過程、細胞部分和分子功能等主要次級分類中的DEGs，均以雄蕾—雌蕾對比組最多。

2. 2. 2 DEGs的KEGG信號通路富集分析結果

KEGG信號通路富集分析結果顯示，3個對比組的DEGs均注釋到KEGG數據庫的50條信號通路上，且這50條信號通路可劃分為細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、代謝和有機系統五大類。其中，雄蕾—雌蕾對比組的DEGs主要參與在植物激素信號傳導、苯丙素的生物合成、內質網中的蛋白質加工、淀粉和蔗糖代謝、嘌呤代謝及嘧啶代謝等通路（圖3）;雄蕾—兩性蕾對比組的DEGs主要參與植物激素信號傳導、淀粉和蔗糖代謝、氨基酸的生物合成、苯丙素的生物合成及嘌呤代謝等通路（圖4）;雌蕾—兩性蕾對比組的DEGs主要參與植物激素信號傳導、苯丙素的生物合成、內質網中的蛋白質加工、淀粉和蔗糖代謝及苯丙氨酸代謝等通路（圖5）。可見，3個對比組均以參與激素信號傳導的DEGs最多，表明植物激素在木薯花性分化中發揮非常重要的作用。

2. 2. 3 DEGs的COG功能注釋分析結果 COG功能注釋分析結果（圖6）顯示，3個對比組的DEGs在COG功能類別中的分布頻率趨勢基本一致。雄蕾—雌蕾、雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾3個對比組均以富集于一般功能預測的DEGs最多，分別為455、285和293個，其次是富集于轉錄的DEGs，分別為306、181和190個，富集于復制、重組和修復的DEGs也較多，分別為289、183和183個;雄蕾—雌蕾、雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾3個對比組富集于信號傳導機制的DEGs分別為269、173和165個。可見，雄蕾—雌蕾對比組大部分COG功能類別的DEGs明顯多于雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾對比組，而雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾對比組間差異不明顯。

2. 3 木薯性別決定關鍵基因篩選結果

2. 3. 1 不同花性型激素相關且差異表達顯著基因分析結果 植物激素是性別分化的重要調控因子。對參與木薯雄蕾、雌蕾和兩性蕾激素信號轉導通路的DEGs進行篩選，結果獲得88個與激素信號轉導相關的DEGs，其中差異表達顯著基因（log2FC>3）有26個，包括編碼生長素運輸載體蛋白（AUX1）的LAX5基因（gene19403和gene7567），生長素/吲哚-3-乙酸（AUX/IAA）的AUX22（gene18980）和ARF9（gene2348）基因;編碼吲哚-乙酸—酰氨基合成酶（CH3）的F24B18.13（gene5960）和OSJNBa0009C 07.16（gene23116）基因;編碼生長素上調miRNA（SAUR）的gene1397、gene19365、gene19962、gene 21742、gene23646、gene3612、gene13617、gene5215和gene9869基因;編碼B型反應調節因子（B-ARR）的ARR18（gene24542）基因;編碼GID1蛋白的T200O 10.110（gene9091）基因;編碼蔗糖非依賴蛋白激酶2（SnRK2）的OOSJNBa0017N12.8（gene21379）基因;編碼生長素響應因子（ABF）的At2g36270（gene 13760）基因;編碼EIN3互作蛋白（EBF1/2）的F13B15.15（gene10983和gene24462）基因;編碼ERF1/2的K14B15.15（gene6396）基因;編碼D3型細胞周期蛋白（CYCD3）的F28A23.80（gene12887）、CYCD3-2（gene22828）和F28A23.80（gene29777）基因;編碼茉莉酸氨基酸合成酶（JAR1）的OSJNBa0009C07.16（gene8657）基因。在雄蕾—雌蕾對比組中，除gene5960、gene1397、gene19365、gene19962、gene21742、gene23646、gene3612、gene9091、gene 21379、gene10983、gene24462、gene6396和gene8657基因顯著下調表達外，其余基因均為顯著上調表達;在雄蕾—兩性蕾對比組中，差異表達顯著基因有gene19403、gene7567、gene18980、gene2348、gene 12887、gene22828和gene29777，均呈上調表達;在雌蕾—兩性蕾對比組中，差異表達顯著基因僅有gene5960、gene1397和gene24462，也均為上調表達。

2. 3. 2 不同花性型差異表達顯著轉錄因子基因分析結果 木薯雄蕾、雌蕾和兩性蕾間差異表達的轉錄因子基因有196個，其中ERF、bHLH、WRKY和MYB 四大類轉錄因子基因所占比例較高，分別為15.31%、17.86%、15.82%和11.22%，其中，log2FC>3的差異表達顯著轉錄因子基因共87個。

與ERF轉錄因子相關的差異表達顯著基因有16個。其中，在雄蕾—雌蕾對比組中上調表達基因為T13E15.15（gene8938）、MQL5_9（gene830）、T13J8.60（gene8664）、ERF017（gene5340和gene5224）、ERF034 （gene811）和ERF109（gene17566），下調表達基因為K14B15.15（gene6396）、ERF011（gene29765和gene 10121）、ERF112（gene4369）、ERF113（gene17021和gene14536）、ERF114（gene23610和gene11659）和T29J13.210（gene2504）;在雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾對比組中差異表達顯著基因各有2個，分別為gene5224和gene17566、gene17021和gene23610，且均呈上調表達。

與WRKY轉錄因子相關的差異表達顯著基因有12個。其中，在雄蕾—雌蕾對比組中上調表達基因為WRKY21（gene9231）和WRKY50（gene5294），下調表達基因共8個，分別為WRKY3（gene972）、WRKY47（gene8490）、WRKY71（gene3445）、WRKY72（gene26615）、WRKY75（gene11601、gene20201和gene 29166）和WRKY6（木薯新基因）;在雄蕾—兩性蕾對比組中，差異表達顯著基因僅有WRKY21（gene9231），為上調表達;在雌蕾—兩性蕾對比組中，上調表達基因共7個，分別為gene972、gene 26615、gene20201、gene11601、WRKY27（gene2799）、WRKY72（gene1819）和WRKY75（gene21757），下調表達基因僅有WRKY13（gene30823）。

與bHLH轉錄因子相關的差異表達顯著基因有16個。其中，在雄蕾—雌蕾比對組中，下調表達基因有3個，分別為T24P15.19（gene13983）、K15N18.2（木薯新基因）和T9N14.4（gene21370），上調表達基因共11個，分別為T28I19.130（gene22708）、MZA15.1（gene27699）、F21F14.120（gene8565）、F2C19.2（gene 27655）、K9D7.15（gene6435）、K21L13.16（gene21284、gene22690和gene29901）和T9N14.4（gene16785、gene 14755和gene26683）;在雌蕾—兩性蕾對比組中，差異表達顯著基因為gene21370、F4F7.28（gene1075）和BHLH84（gene10165），均呈上調表達;在雄蕾—兩性蕾對比組中，上調表達基因為gene27699、gene 8565、gene29901、gene22690、gene26683和gene14755，下調表達基因僅有K15N18.2（木薯新基因）。

與MYB轉錄因子相關的差異表達顯著基因有11個。其中，在雄蕾—雌蕾對比組中，上調表達基因為F5E6.18（gene24177）、dl4925c（gene28472和gene 3091）和F21E10.4（gene11478），下調表達基因為MYB23（gene3024）、K8K14.2（gene338、gene9413、gene21632和gene16518）和F21E10.4（gene18714和gene8156）;在雄蕾—兩性蕾對比組中，差異表達顯著基因僅有gene16518，為上調表達;在雌蕾—兩性蕾對比組中，差異表達顯著基因有gene24177、gene28472和gene11478，也均為上調表達。

與GATA、NAC和AP2/ARF等轉錄因子相關的差異表達顯著基因有32個。其中，在雄蕾—雌蕾比對組中，上調表達基因有23個，分別為AIL1（gene8193和gene18671）、T28I19.30（gene10192、gene29853和gene21252）、VRN1（gene26272）、T24C20.40（gene 11390）、GATA18（gene1303）、F2G19.8（gene29751）、gene3936、ETC1（gene28492）、At1g69490（gene23213）、MFO20.5（gene10053）、T2E6.2（gene29522）、GTE12（gene15183）、gene23167、At1g32640（gene527）、RF2b（gene17041）、MFH8.15（gene11593、gene23355）、TCP15（gene1803）、TCP5（gene11227）和T10P11.13（gene14873），下調表達基因有6個，分別為At1g69490（gene9425）、ONAC010（gene16597和gene14996）、NFYB5（gene9042）、gene31152和T1008.90（gene 16230）;在雌蕾—兩性蕾對比組中，上調表達基因有gene16597、gene31152、At1g74500（gene23918）和T1008.90（gene16230），下調表達基因僅有T8M 16.100（gene29946）;在雄蕾—兩性蕾對比組中，差異表達顯著基因有gene18671、gene21252、gene29751、gene3936、gene23355、gene1803和TAF8（木薯新基因），均呈上調表達。

3 討論

近年來，轉錄組差異分析技術已廣泛應用于動植物有關基因的發掘研究。周大顏等（2019）利用RNA-seq技術構建3種白鯽雜交子代轉錄組文庫并進行測序分析，獲得參與抗氧化、免疫和生長發育相關的通路和基因序列等，可用于白鯽的選擇性育種和分子標記開發等研究。韋麗君等（2020）應用Illumina HiSeqTM 4000測序平臺對木薯花芽與葉芽進行轉錄組測序，結果獲得開花相關基因47個，在一定程度上解析了木薯花芽分化的分子機制。在轉錄組分析研究中，轉錄組測序數據組裝質量評估是功能注釋、分類和差異基因篩選的前提（張加強等，2018）。本研究單個樣品的高質量堿基數均在6.30 Gb以上，堿基質量值Q30均在95.00%左右，表明堿基識別可靠，準確度高。比對率是轉錄組數據利用率的最直接體現，在本研究獲得的木薯花蕾測序數據中，參考基因組和單端的比對率均較高（在77.00%左右），說明所選參考基因組組裝能滿足后續信息分析的需求。本研究從木薯雌蕾、雄蕾和兩性蕾中得到Clean reads分別為21321136、21086201和21781716條，高質量堿基為6.38、6.30和6.51 Gb，表明這些數據質量和完整性可滿足后期分析需要。但與木薯花芽和葉芽的轉錄組學分析結果（韋麗君等，2020）相比，本研究中的Clean reads和高質量堿基數目較少，可能是不同發育時期的樣本差異所致，因為花芽分化是植物從營養生長轉為生殖生長的標志，此時芽的外部形態和內在生理生化等均發生明顯變化，對應的轉錄組數據也相對多而復雜。

當前，有關植物性別分化的分子機理研究主要涉及DEGs及有關基因的篩選。閆明科等（2015）對獼猴桃雌花和雄花的miRNA進行測序，結果發現170個miRNA家族成員在雌花和雄花間顯著差異表達。閆春冬（2018）研究發現，強雌和強雄材料間的DEGs有可能參與性別分化，進而影響雌花或雄花的轉化。本研究結果顯示，雄蕾—雌蕾對比組的DEGs數量較雄蕾—兩性蕾和雌蕾—兩性蕾對比組多，說明雌花和雄花是性狀完全不同的兩種花，且兩性花同時具有雌、雄兩種器官，與任一種單性花均存在相似之處。閆明科等（2015）研究顯示，獼猴桃雌花和雄花間差異表達顯著基因主要富集于細胞組分的細胞和細胞部分、分子功能的結合和催化及生物學過程的代謝過程和細胞過程，與本研究的GO功能富集分析結果一致，說明在不同植物的性別分化過程中，分子間結合和催化反應推進細胞部件重塑新細胞的同時，代謝反應和胞間通訊也非常活躍。此外，植物內源激素參與調控花器官分化過程（Chen et al.，2017;Tao et al.，2018）。盛云燕等（2012）研究證實，甜瓜的性別分化與赤霉素、脫落酸、半胱氨酸、蛋氨酸、油菜素內酯及玉米素等多種激素合成、信號傳導等代謝途徑相關。本研究中的KEGG信號通路富集分析和COG功能注釋分析結果均顯示，3個對比組均以參與激素信號傳導的DEG最多，說明激素信號傳導廣泛參與木薯性別決定的調控，在木薯花性分化過程中發揮關鍵作用。

生長素早期響應因子如Aux/IAA家族、ABF家族和SAUR等在生長素的信號傳導中發揮重要作用。本研究獲得88個與激素相關的DEGs，涉及生長素早期影響因子的基因約占44.32%，其中log2FC>3的差異表達顯著基因有15個（共26個），表明生長素早期因子在木薯的性別分化過程中扮演著重要角色。杜改改等（2017）對柿雌花和雄花進行轉錄組測序分析，共篩選出10個與激素相關的典型基因，其中編碼AUX/IAA響應蛋白的IAA3和IAA32基因在雌花中上調表達。本研究中，表達差異顯著的生長素影響因子基因LAX5（gene19403和gene7567）、AUX22（gene18980）和ARF9（gene2348）在雌花和兩性花中上調表達，且在雌花中的表達量高于兩性花，編碼SAUR的基因gene1397、gene19365、gene19962、gene 21742、gene23646、gene 3612、gene13617、gene5215、gene9869和編碼CH3的基因F24B18.13（gene5960）在雄花中均上調表達，推測木薯中的LAX5、AUX22和ARF9具有促雌或抑雄的調控功能，編碼SAUR和CH3的基因功能則恰好相反。CYCD3在從細胞增殖轉向分化的最后階段中發揮關鍵作用（Dewitte et al.，2007），其基因表達上調與花序分生組織的增多密切相關（Pan et al.，2014 ）。本研究中與CYCD3相關的基因F28A23.80（gene12887）、CYCD3-2（gene 22828）、F28A23.80（gene29777和gene31176）在雌花和兩性花中顯著上調表達，但在雌花中的表達量高于兩性花，推測木薯中編碼CYCD3的基因與雌花和兩性花的性別決定密切相關。

B類ARRs是細胞分裂素響應的正調節因子（Mason et al.，2005），A類ARRs作為細胞分裂素的負調控因子可抑制B類ARRs的活性（To and Kieber.，2008）;在脫落酸信號通路中，SnRK2信號在蕨類植物的性別決定中發揮重要作用，調節生殖周期中雄性與雌雄同體間的性別比例（McAdam et al.，2016）。肖楓（2019）對膏桐雌花與雄花的轉錄組差異分析結果顯示，A-ARR（gene13354）在雌花中顯著上調表達，SnRK2（gene20150）、ABF（gene13255和gene14512）和B-ARR（gene20147）在雄花中顯著上調表達。本研究中，編碼ABF的基因At2g36270（gene 13760）和編碼B-ARR的基因ARR18（gene24542）在木薯雌花中上調表達，編碼SnRK2的基因OOSJNBa0017N12.8（gene21379）在雄花中上調表達，說明木薯和膏桐中編碼這些蛋白的基因均參與性別決定調控，但作用機制可能存在差異。此外，本研究中編碼GID1的基因T20O10.110（gene9091）、編碼EBF1/2的基因F13B15.15（gene10983和gene24462）、編碼ERF1/2的基因K14B15.15（gene6396）和編碼JAR1的基因OSJNBa0009C07.16（gene8657）在木薯雄花中均顯著上調表達，說明這些基因與木薯雄花的性別決定密切相關。

轉錄因子又稱反式作用因子，其作為一類重要的調控基因，主要通過結合基因啟動子區域中的順式作用元件而發揮調控作用，是近年來基因挖掘與功能分析領域的研究熱點（賈翠玲和侯和勝，2010）。至今，越來越多的研究證實轉錄因子在植物花發育，尤其在花藥和花粉的發育中發揮重要的調控作用。如AP2/ERF與花發育相關（Jofuku et al.，1994;Serra et al.，2013）;AtMYB103可通過調節植物絨氈層的發育來調控花粉發育（Higginson et al.，2003）;bHLH轉錄因子激活并調控開花基因表達（Shogo et al.，2012）。本研究結果表明，在木薯雄蕾、雌蕾和兩性蕾中差異表達的轉錄因子基因有196個，其中ERF、bHLH、WRKY和MYB四大類轉錄因子基因所占比例較大，log2FC>3的轉錄因子基因數量也較多，推測這此轉錄因子參與木薯的性別決定，其相關基因對木薯的性別決定起重要調控作用。Nakata等（2013a，2013b）在擬南芥中鑒定出參與茉莉酸信號傳導的3個bHLH轉錄因子（JAM1、JAM2和JAM3），并分別對其基因進行過表達，結果發現轉基因植株均表現出雄蕊育性降低，暗示這3個bHLH轉錄因子在擬南芥雄蕊發育中起負調控作用。在本研究中，相對于木薯雄蕾，雌蕾和兩性蕾中的大部分ERF、bHLH和MYB轉錄因子均表現上調，尤其是bHLH和MYB類轉錄因子，上調表達基因數量遠多于下調表達基因數量;而WRKY轉錄因子恰好相反;在雄蕾—雌蕾對比組中，下調表達的轉錄因子基因數量遠多于上調表達的轉錄因子基因數量。由此推測，木薯中的絕大部分ERF、bHLH和MYB轉錄因子具有促雌或抑雄功能，而WRKY類轉錄因子恰好相反，大部分具有抑雌或促雄功能。

4 結論

木薯不同花性型存在較多的DEGs，其中與生長素及ERF、bHLH、WRKY和MYB轉錄因子相關的基因均與性別決定密切相關，可能是木薯性別分化的關鍵調控基因。

參考文獻：

杜改改，孫鵬，索玉靜，韓衛娟，刁松鋒，傅建敏，李芳東. 2017. 基于柿雌雄花芽轉錄組測序的SSR和SNP多態性分析[J]. 中國農業大學學報，22（10）：45-55. [Du G G，Sun P，Suo Y J，Han W J，Diao S F，Fu J M，Li F D. 2017. SSR and SNP polymorphism analysis based on persimmon （Diospyros kaki） transcriptome[J]. Journal of China Agricultural University，22（10）：45-55.]

賈翠玲，侯和勝. 2010. 植物WRKY轉錄因子的結構特點及其在植物防衛反應中的作用[J]. 天津農業科學，16（2）：21-26. [Jia C L，Hou H S. 2010. Structure of plant WRKY transcription factors and their roles in plant defense responses[J]. Tianjin Agricultural Scriences，16（2）：21-26.]

賈慧敏. 2016. 楊梅全基因組測序和雌雄性別控制遺傳分析[D]. 杭州：浙江大學. [Jia H M. 2016. The draft genome of Chinese bayberry（M. rubra） and genetic analysis of sex determination between male and female plants[D]. Hangzhou：Zhejiang University.]

焦曉博，羅堯幸，趙偉，劉榕晨，李雪雪，紀薇. 2018. 葡萄MYB基因家族及其對花器官性別分化調控的分析[J]. 山西農業大學學報（自然科學版），38（5）：23-32. [Jiao X B，Luo Y X，Zhao W，Liu R C，Li X X，Ji W. 2018. Analysis of grape MYB gene family and its regulation on sex differentiation of flower organs[J]. Journal of Shanxi Agri-cultural University（Natural Science Edition），38（5）：23-32.]

劉孟，乜蘭春，王珊珊，胡淑明. 2016. 蘆筍三種花蕾性別分化相關差異蛋白表達分析[J]. 中國農業科學，49（21）：192-4202. [Liu M，Nie L C，Wang S S，Hu S M. 2016. Expression analysis of aifferential proteins in three kinds of flower buds with sex differentiation of asparagus[J]. Scien-tia Agricultura Sinica，49（21）：4192-4202.]

毛穎基. 2017. 油桐花發育及其性別決定機制研究[D]. 合肥：中國科學技術大學. [Mao Y J. 2017. The floral development and sex determination mechanism of vernicia fordii[D]. Hefei：University of Science and Technology of China.]

彭向永. 2017. 雌、雄蒿柳花芽分化機制及性別決定基因挖掘[D]. 北京：中國林業科學研究院. [Peng X Y. 2017. Mechanism of floral bud differentiation and discovery of sex determination genes in male and female Salix viminalis[D]. Beijing：Chinese Academy of Forestry.]

秦力. 2016. 蘆筍雌雄花發育轉錄組分析及性別決定相關miRNA靶基因的鑒定[D]. 杭州：浙江大學. [Qin L. 2016. Comparative transcriptome analysis of male and female flowers and identification of gender-related miRNA targets in Asparagus officinalis L[D]. Hangzhou：Zhejiang University.]

盛云燕，劉識，李文濱，欒非時. 2012. 與甜瓜性別分化相關植物激素生物合成途徑分析[J]. 農業生物技術學報，20（7）：791-798. [Sheng Y Y，Liu S，Li W B，Luan F S. 2012. Hormone pathway analysis related to sex determination in melon（Cucumismelo L.）[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，20（7）：791-798.]

韋麗君，俞奔馳，呂平，檀小輝，雷開文，馬崇熙，盧賽清，唐玉娟. 2020. 木薯葉芽和花芽的轉錄組差異分析[J]. 分子植物育種，18（7）：2108-2117. [Wei L J，Yu B C，Lü P，Tan X H，Lei K W，Ma C X，Lu S Q，Tang Y J. 2020. Transcriptome difference analysis of cassava（Mahihot esculehta） leaf bud and flower bud[J]. Molecular Plant Breeding，18（7）：2108-2117.

肖楓. 2019. 皺葉膏桐成花相關基因的克隆及分析[D]. 貴陽：貴州大學. [Xiao F. 2019. Cloning and analysis of genes related to flowering of Jatropha nigroviensrugosus[D]. Guiyang：GuiZhou University.]

薛麗君. 2015. 苧麻性別分化相關基因的克隆、表達及遺傳轉化研究[D]. 長沙：湖南農業大學. [Xue L J. 2015. Clo-ning，expression and genetic transformation of genes rela-ted to sex differention in ramie[D]. Changsha：Hunan Agricultural University.]

閆春冬. 2018. 南瓜性別分化轉錄組及差異表達基因分析[D]. 哈爾濱：東北農業大學. [Yan C D. 2018. Sex di-fferentiation transcriptome and differentially expressed genes analysis in pumpkin[D]. Harbin：Northeast Agricultural University.]

閆明科，徐強，劉春燕，張瓊，姚小洪. 2015. 基于microRNA深度測序的獼猴桃性別分化初探[J]. 園藝學報，42（7）：1260-1272. [Yan M K，Xu Q，Liu C Y，Zhang Q，Yao X H. 2015. Preliminary investigation on sex differentiation of Actinidia chinensis by high-throughput microRNAs sequencing[J]. Acta Horticulturae Sinica，42（7）：1260-1272.]

俞奔馳，韋麗君，李軍，田益農，盧賽清. 2017. 木薯兩性花及其種子的形態特征[J]. 植物學報，52（2）：175-178. [Yu B C，Wei L J，Li J，Tian Y N，Lu S Q. 2017. Morphological characteristics of bisexual flowers and seeds in cassava[J]. Bulletin of Botany，52（2）：175-178.]

俞奔馳，羅燕春，李軍，黃強，盤歡，鄭華，文峰，付海天，陳顯雙，馬崇熙，田益農. 2014. 一種木薯開花調控技術.中國[P]. CN103733859A. [Yu B C，Luo Y C，Li J，Huang Q，Pan H，Zheng H，Wen F，Fu H T，Chen X S，Ma C X，Tian Y N. 2014. Flowering induction technology of cassava. China[P]. CN103733859A.]

周大顏，張志新，黃彩林，招志杰，莫飛龍. 2019. 3種白鯽雜交子代的轉錄組學分析[J]. 南方農業學報，50（6）：1328-1338. [Zhou D Y，Zhang Z X，Huang C L，Zhao Z J，Mo F L. 2019. Transcriptomic analysis of three Carassius auratus cuvieri hybrids[J]. Journal of Southern Agriculture，50（6）：1328-1338.]

張加強，史小華，劉慧春，馬廣瑩，鄒清成，朱開元，周江華，毛軍銘. 2018. 基于轉錄組學的不同色系蝴蝶蘭花色苷差異積累分析[J]. 分子植物育種，16（14）：4530-4542. [Zhang J Q，Shi X H，Liu H C，Ma G Y，Zou Q C，Zhu K Y，Zhou J H，Mao J M. 2018. Study on the differential accumulation of anthocyanin in different-colored phalaenopsis based on transcriptomics[J]. Molecular Plant Bree-ding，16（14）：4530-4542.]

Chen L N，Zhang J，Li H X，Niu J，Xue H，Liu B B，Wang Q，Luo X，Zhang F H，Zhao D G，Cao S Y. 2017. Transcriptomic analysis reveals candidate genes for female sterility in pomegranate flowers[J]. Front Plant science，8：1430. doi：10.3389/fpls.2017.01430. eCollection 2017.

Dewitte W，Scofield S，Alcasabas A A，Maughan S C，Menges M，Braun N，Collins C，Nieuwland J，Prinsen E，Sundaresan V，Murray J A H. 2007. Arabidopsis CYCD3 D-type cyclins link cell proliferation and endocycles and are rate-limiting for cytokinin responses[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，104（36）：14537-14542.

Heikrjam M，Sharma K，Prasad M，Agrawal-Euphytica V. 2015. Review on different mechanisms of sex determination and sex-linked molecular markers in dioecious crops;a current update[J]. Euphytica，201（2）：161-194.

Higginson T，Li S F，Parish R W. 2003. AtMYB103 regulates tapetum and trichome development in arabidapsis thaliana[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology，35（2）：177-192.

Jofuku K D，Den Boer B G，van Montagu M，Okamuro J K. 1994. Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene APETALA2[J]. The Plant Cell，6（9）：1211-1225.

Leng N，Dawson J A，Thomson J A，Ruotti V，Rissman A I，Smits B M G，Haag J D，Gould M N，Stewart R M，Kendziorski C. 2013. EBSeq：An empirical bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments[J]. Bioinformatics，29（8）：1035-1043.

Mason M G，Mathews D E，Argyros D A，Maxwell B B，Kieber J J，Alonso J M，Schaller G E. 2005. Multiple type-B response regulators mediate cytokinin signal transduction in Arabidopsis[J]. The Plant Cell，17（11）：3007-3018.

McAdam S A，Brodribb T J，Banks J A，Hedrich R，Atallah N M，Cai C，Geiger D. 2016. Abscisic acid-controlled sex before transpiration in vascular plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，113（45）：12862-12867.

Nakata M，Mitsuda N，Herde M，Koo A J K，Moreno J E，Suzuki K，Howe G A，Ohme-Takagi M. 2013a. A bHLH-type transcription factor，ABA-INDUCIBLE BHLH-TYPE TRANSCRIPTION FACTOR/JA-ASSOCIATED MYC2-LIKE1，acts as a repressor to negatively regulate jasmonate signaling in Arabidopsis[J]. The Plant Cell，25（5）：1641-1656.

Nakata M，Ohme-Takagi M. 2013b. Two bHLH-type transcription factors，JA-ASSOCIATED MYC2-LIKE2 and JAM3，are transcriptional repressors and affect male fertility[J]. Plant Signaling & Behavior，8（12）：e26473.

Pan B Z，Chen M S，Jun N，Xu Z. 2014. Transcriptome of the inflorescence meristems of the biofuel plant Jatropha curcas treated with cytokinin[J]. BMC Genomics，15：974. doi：10.1186/1471-2164-15-974.

Serra T S，Figueiredo D D，Cordeiro A M，Almeida D M，Louren?o T，Abreu I A，Sebastián A，Fernandes L，Contreras-Moreira B，Oliveira M M，Saibo N J. 2013. OsRMC，a negative regulator of salt stress response in rice，is regulated by two AP2/ERF transcription factors[J]. Plant Molecular Biology，82（4-5）：439-455.

Shogo I，Song Y H，Josephson-Day A R，Miller R J，Breton G，Olmstead R G，Imaizumi T. 2012. Flowering bHLH transcriptional activators control expression of the photoperiodic flowering regulator constans in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，109（9）：3582-3587.

To J P，Kieber J J. 2008. Cytokinin signaling：Two-components and more[J]. Trends in Plant Science，13（2）：85-92.

Tao Q Y，Niu H H，Wang Z Y，Zhang W H，Wang H，Wang S H，Zhang X，Li Z. 2018. Ethylene responsive factor ERF110 mediates ethylene-regulated transcription of a sex determination-related orthologous gene in two Cucumis species[J]. Journal of Experimental Botany，69（12）：2953-2965.

（責任編輯 陳 燕）

收稿日期：2020-02-25

基金項目：廣西自然科學基金項目（2017GXNSFBA198172）;廣西科技計劃項目（桂科AB1850037）;國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-11）

作者簡介：*為通訊作者，俞奔馳（1973-），高級農藝師，主要從事木薯育種研究工作，E-mail：yubenchi@126.com。韋麗君（1979-），博士，高級農藝師，主要從事木薯分子生物學及育種研究工作，E-mail：215377275@qq.com

優 秀 青 年 學 者 論 壇

韋麗君（1979-），博士，高級農藝師，主要從事木薯分子生物學及育種研究工作。主持有廣西重點研發計劃項目“基于開花調控的木薯兩性花育種新技術的應用與示范”、廣西自然科學基金項目“基于EST數據的木薯成花預測與分析”和廣西亞熱帶作物研究所專項“涼蔗基因組SNP標記的開發與應用研究”等科研項目;作為主要成員參與省部級項目“木薯特異種質資源的引進與利用研究”“木薯花藥離體培養技術研究”及“秋水仙素誘導木薯多倍體的研究”等20余項。獲授權國家發明專利4項、實用新型專利3項，參與選育（認定）作物新品種4個;在《植物學報》《植物生理學報》《南方農業學報》《西北植物學報》等期刊上合著發表學術論文48篇，其中第一作者或通訊作者18篇。