FoxO3轉錄因子在雞卵巢組織中的表達鑒定

洪永興　彭臘如　黃振文　徐天鵬　濮黎萍　虞霖田　謝龍　廖玉英　陸陽清

摘要：【目的】明確FoxO3轉錄因子在不同日齡雞卵巢組織中的表達模式及其具體定位情況，為后續開展家禽卵泡激活及發育調控等相關機理研究提供科學依據。【方法】在GenBank中搜索雞與其他物種（鴨、鵝、老鼠、豬、牛及人類）的FoxO3氨基酸序列，通過LaserGene分析雞FoxO3氨基酸序列與其他物種FoxO3氨基酸序列間的親緣關系及同源差異情況;利用RT-PCR鑒定FoxO3基因是否在雞卵巢組織中表達，再采用實時熒光定量PCR檢測不同發育階段雞卵巢組織中FoxO3基因的表達水平，最后以免疫熒光檢測FoxO3蛋白在雞卵巢組織中的定位情況。【結果】雞與鴨和鵝的FoxO3氨基酸序列相似性分別為92.7%和95.3%，基于FoxO3氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹也顯示雞與鴨和鵝的親緣關系較近，說明FoxO3基因的進化相對較保守。在不同發育階段的雞卵巢組織中均能檢測到FoxO3基因表達，且FoxO3基因在0日齡雞卵巢組織中的相對表達量最高，顯著高于在其他發育階段的相對表達量（P<0.05）。在0日齡雞卵巢組織中未檢測到FoxO3蛋白，但在21日齡和成年雞的卵巢組織中均能檢測到FoxO3蛋白;在21日齡雞卵巢組織中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡細胞周圍，在卵泡內部沒有表達;而在成年雞卵巢組織中FoxO3蛋白僅定位于大卵泡細胞邊緣，小卵泡細胞內并未發現FoxO3蛋白。【結論】由于雞和哺乳動物的FoxO3氨基酸序列高度同源，且FoxO3蛋白在雞卵巢組織中的定位與在哺乳動物卵巢組織中的定位相似，說明FoxO3在雞卵巢組織中發揮著與哺乳動物相似的功能，即在卵泡激活與成熟過程中發揮重要作用，因此通過調控FoxO3能有效提高雞的繁殖性能。

關鍵詞： 雞;FoxO3轉錄因子;卵巢;卵泡激活;表達定位

中圖分類號： S831.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1849-08

Identification of expression of FoxO3 transcription factor in chicken ovaries

HONG Yong-xing1， PENG La-ru1， HUANG Zhen-wen1， XU Tian-peng1， PU Li-ping1，

YU Lin-tian2， XIE Long1， LIAO Yu-ying3，? LU Yang-qing1*

（1College of Animal Science and Technology， Guangxi University/State Key Laboratory of Subtropical Agricultural Biological Resources Conservation and Utilization， Nanning? 530004， China; 2Guangxi Agricultural Vocational and Technical College， Nanning? 530007， China; 3Guangxi Animal Husbandry Research Institute， Nanning? 530021， China）

Abstract：【Objective】The expression pattern and specific localization of FoxO3 transcription factor in ovarian tissue of chickens at different ages were determined， providing a basis for the subsequent studies on related mechanisms such as follicular activation and developmental regulation in poultry. 【Method】FoxO3 amino acid sequences of chicken and other species（duck， goose， mouse， pig， ox and human） were searched in GenBank， and the genetic relationship and homologous difference between FoxO3 amino acid sequence of chicken and FoxO3 amino acid sequence of other species were analyzed by Laser Gene. RT-PCR was used to identify whether FoxO3 gene was expressed in chicken ovarian tissue. Then real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect FoxO3 gene expression level in chicken ovarian tissue at different stages. Finally， immunofluorescence was used to detect FoxO3 protein localization in chicken ovarian tissue. 【Result】The similarity of FoxO3 amino acid sequence between chicken and duck and goose was 92.7% and 95.3%， respectively. The phylogenetic tree based on T-PCR similarity also showed that chicken was closely related to duck and goose， indicating that FoxO3 gene was relatively conservative in evolution.FoxO3 gene expression could be detected in different stages of chicken ovarian tissue， and the relative expression level of FoxO3 gene in 0-day-old chicken ovarian tissue was the highest， significantly higher than the relative expression level in other stages（P<0.05）. FoxO3 protein was not detected in the ovarian tissue of 0-day-old chickens， but FoxO3 protein was detected in the ovarian tissue of 21-day-old and adult chi-ckens. FoxO3 protein was mainly localized around the original follicle cells in the ovarian tissue of chicken at 21 days old， but was not expressed in the follicle. FoxO3 was found only at the edges of large follicular cells in adult chicken ova-rian tissue， but not in small follicular cells. 【Conclusion】Since the chicken and mammals FoxO3 amino acid sequence has high homology， the location in the chicken and FoxO3 protein in ovarian tissue is similar to the location in the ovarian tissue in mammals， which indicates thatFoxO3 in chicken ovary organization plays a similar function as mammals.The follicle plays an important role in the process of activation and mature， so through regulating FoxO3 can effectively increase the reproductive performance of chicken.

Key words： chicken; FoxO3 transcription factor; ovary; follicle activation; localization of gene expression

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960157）

0 引言

【研究意義】叉頭框（Forkhead box，Fox）轉錄因子最早在果蠅上被發現，其在大腸桿菌及人類細胞中均有表達，可發揮多種生物學效應（Jünger et al.，2003）。Fox家族具有許多亞族，其中O亞家族（FoxO）被稱為癌因子或腫瘤抑制因子，在癌癥的發生和發展過程中發揮重要作用（張楠和王育，2015;黃林艷等，2019;Gurnari et al.，2019）。FoxO通過不同的信號通路調節細胞生長發育，其中FoxO3在動物卵泡激活及其成熟過程中起調節作用（Pelosi et al.，2013;陳亞楠等，2016;黃堅毅等，2019）。因此，探究FoxO3在家禽卵泡中的生物學作用，對揭示家禽產蛋機理及提高其繁殖性能均具有重要意義。【前人研究進展】目前，已知的FoxO亞家族由FoxO3a（FKHRL1）、FoxO1（FKHR）和FoxO4（AFX）組成，均為PTEN/PI3K/AKT通路的下游效應子（Tran et al.，2003;黃堅毅等，2019），參與細胞增殖、細胞凋亡、抗應激、細胞分化及代謝等多種生物學過程（Accili and Arden，2004;周驊等，2017），但需經磷酸化、乙酰化或泛素化等修飾后才能發揮作用（周振琪，2007;van der Horst and Burgering，2007）。其中，FoxO3a因與人類壽命存在密切聯系而引起廣泛關注，也被稱為長壽基因（Miyamoto et al.，2007;Notas et al.，2012）。FoxO3可通過信號通路調控細胞凋亡相關基因轉錄，進而促進細胞凋亡（Nepal et al.，2015;Hou et al.，2016;黃堅毅等，2019）。已有研究表明，FoxO3是蛋白降解途徑中的激活物，能通過促進肌肉萎縮因子表達而誘導肌肉萎縮（Lee et al.，2004;Sandri et al.，2004）。Castrillon等（2003）研究發現，敲除雌性小鼠FoxO3a基因后表現出全部卵泡激活的卵巢表型，導致卵母細胞死亡、功能性卵巢卵泡早期耗竭和繼發性不育，進一步證實FoxO3在卵泡生長最早階段主要發揮抑制卵泡激活的作用。此外，FoxO3可通過調控細胞周期相關基因來延長細胞周期（Du et al.，2016）。在雞的相關研究領域，Chen等（2019）研究表明，FoxO3不僅能抑制雞肝癌細胞系（LMH）增殖，促進細胞凋亡，還與雞的生長發育存在密切聯系;Lee等（2019）通過抑制FoxO3基因在雞成肌細胞中的表達，發現其成肌細胞增殖率明顯低于正常成肌細胞，說明FoxO3具有促進雞成肌細胞增殖的作用。【本研究切入點】鑒于FoxO3在動物卵泡激活及卵母細胞發育過程中發揮的重要作用，故推測其在雞卵巢內也具有抑制卵泡激活的作用，即通過控制蛋雞FoxO3基因表達可增加蛋雞的產蛋量，但至今有關家禽FoxO3的相關研究仍處于初級階段，尚未明確其在雞卵巢中的定位及功能作用。【擬解決的關鍵問題】通過構建系統發育進化樹比對分析家禽（雞、鴨和鵝）與哺乳動物（豬、牛、小鼠及人類）的FoxO3氨基酸序列相似性，并以實時熒光定量PCR和免疫熒光等方法檢測FoxO3基因在不同發育階段雞卵巢中的表達模式及其具體定位情況，為后續開展家禽卵泡激活及發育調控等相關機理研究提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試廣西麻雞（0日齡、21日齡和成年雞各3羽）購自廣西富鳳農牧集團有限公司。ProLongTM Gold Antifade Mountant with DAPI（P36931）購自Invitrogen公司，E.Z.N.A Total RNA Kit I（R6834-02）購自OMEGA Bio-tek Inc.公司，Alexa Fluor 488 GOAT A 0.5 ML（A11034）購自Thermo-life公司，EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AE311-04）購自TransGen Biotech公司，TB GreenTM Premix Ex Taq II（RR820A）購自TaKaRa公司，Albumin from Bovine Serum（A9418-50G）購自Sigma公司，4%多聚甲醛購自北京博奧拓達科技有限公司，二甲苯和無水乙醇購自天津富宇精細化工有限公司。主要儀器設備：Milli-Q純水系統（美國Milli-Q公司），2T-12M型組織脫水機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司），倒置顯微鏡TH4-200（日本Olympus公司），免疫熒光系統（日本Olympus公司），CFX96TM Real-Time System（Bio-Rad公司）。

1. 2 生物信息學分析

在GenBank中搜索雞與其他物種（鴨、鵝、小鼠、豬、牛及人類）的FoxO3氨基酸序列，通過LaserGene分析雞FoxO3氨基酸序列與其他物種FoxO3氨基酸序列間的親緣關系及同源差異情況，以MEGA 10.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹。

1. 3 擴增引物設計與合成

根據GenBank已公布的雞FoxO3基因序列，利用Primer 5.0設計特異性引物（表1），并委托深圳華大基因股份有限公司合成。

1. 4 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

取雞卵巢組織塊迅速加入液氮研磨至粉末，利用RNA提取試劑盒[E.Z.N.A Total RNA Kit I（R6834-02）]提取總RNA，然后按照反轉錄試劑盒[Easy-Script? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AE311-04）]說明將提取的總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈。

1. 5 PCR擴增

以反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系20.0 μL，其中，1.0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 10.0 ?L，cDNA模板10 ng，加Milli-Q水補足至20.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性10 s;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 5 s，進行40個循環;72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1. 6 實時熒光定量PCR檢測

以GAPDH基因為內參基因進行實時熒光定量PCR擴增，反應體系20.0 μL，其中，1.0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，TB GreenTM Premix Ex Taq II 10.0 ?L，cDNA模板10 ng，加Milli-Q水補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環;熔解程序：95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。

1. 7 免疫熒光定位檢測

分別取0日齡、21日齡及成年雞的卵巢組織，在4 ℃下以4%多聚甲醛固定過夜，經組織脫水機自動脫水、透明及浸蠟后，制作3～5 μm的石蠟切片。參考黃斌等（2018）的方法進行免疫熒光染色：切片經脫蠟梯度復水后，在95 ℃下處理20 min進行抗原修復;以5% H2O2處理切片組織15 min，去除內源性過氧化氫酶;在室溫下以3%牛血清白蛋白（BSA）封閉1.5 h，滴加一抗（按說明比例稀釋于含5% BSA的PBS中）后置于4 ℃濕盒過夜，滴加堿性磷酸酶標記的二抗（按說明比例稀釋于含5% BSA的PBS中）后在室溫下孵育1.0 h，再滴加DAPI和放淬滅劑，封片，于熒光顯微鏡下進行鏡檢。

2 結果與分析

2. 1 FoxO3基因生物信息學分析結果

為檢測家禽（雞、鴨和鵝）與哺乳動物（小鼠、牛、豬及人類）的FoxO3基因種間差異，采用MegAlign對各物種的FoxO3氨基酸序列進行比對，并基于FoxO3氨基酸序列相似性構建雞與其他6個物種的系統發育進化樹，結果顯示，雞FoxO3氨基酸序列與鴨、鵝、小鼠、牛、豬及人類FoxO3氨基酸序列的相似性分別為92.7%、95.3%、78.5%、79.1%、78.6%和78.9%（圖1），從構建的系統發育進化樹也可知，雞與鴨和鵝的親緣關系較近，聚類在同一分支上（圖2），說明FoxO3基因的進化相對較保守。

2. 2 FoxO3基因在雞卵巢組織中的表達鑒定結果

為檢測FoxO3基因在雞卵巢組織中是否表達，以反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖3）顯示在180 bp附近獲得1條明亮的目的條帶，經測序證實其為雞FoxO3基因編碼區（CDS）序列片段，說明FoxO3基因在雞卵巢組織中有表達。

2. 3 雞FoxO3基因實時熒光定量PCR的熔解曲線

GAPDH基因和FoxO3基因實時熒光定量PCR的熔解曲線如圖4所示。GAPDH基因和FoxO3基因的熔點分別為86.0和80.5 ℃，熔解曲線均呈單峰，說明本研究設計的擴增引物特異性強，無引物二聚體等非特異性擴增，即實時熒光定量PCR檢測數據準確可信。

2. 4 雞FoxO3基因實時熒光定量PCR檢測結果

從圖5可看出，除空白對照未擴增出對應的熒光曲線外，從不同日齡雞卵巢組織中均能擴增出GAPDH基因和FoxO3基因的熒光曲線，表明總RNA提取質量及cDNA反轉錄合成效果良好，且實時熒光定量PCR檢測結果可信。

2. 5 FoxO3基因在雞卵巢組織中的表達情況

為檢測不同發育階段雞卵巢組織中FoxO3基因的表達情況，分別收集0日齡、21日齡和成年雞的卵巢組織，提取各發育階段雞卵巢組織總RNA，采用實時熒光定量PCR測定FoxO3基因的表達量。由于FoxO3基因在原始生殖干細胞（PGCs）中的表達量較低，故將其設為對照樣本。如圖6所示，在不同發育階段的雞卵巢組織中均能檢測到FoxO3基因表達，且FoxO3基因在0日齡雞卵巢組織中的相對表達量最高，顯著高于在其他發育階段的相對表達量（P<0.05）;FoxO3基因在21日齡和成年雞卵巢組織中的相對表達量差異不顯著（P>0.05）。

2. 6 FoxO3蛋白在雞卵巢組織中的定位情況

為檢測FoxO3蛋白在不同發育階段雞卵巢組織中的定位情況，分別收集0日齡、21日齡和成年雞的卵巢組織，按常規方法制作石蠟切片后進行免疫熒光染色。免疫熒光染色結果表明，在0日齡雞卵巢組織中未檢測到FoxO3蛋白（圖7），而在21日齡（圖8）和成年雞（圖9）卵巢組織中均能檢測到FoxO3蛋白。結合熒光定位來看，在21日齡雞卵巢組織中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡細胞周圍，在卵泡內部沒有表達;而在成年雞卵巢組織中FoxO3蛋白僅定位于大卵泡細胞邊緣，小卵泡細胞內并未發現FoxO3蛋白。

3 討論

哺乳動物的卵母細胞被顆粒細胞緊密包圍形成原始卵泡，且在很長一段時間內保持靜止狀態。FoxO3是維持卵巢儲備功能的重要轉錄因子，嚴格管控著卵泡募集和激活等過程，以防止早期卵泡儲集層過早衰竭（卵巢功能早衰）（Schlessinger et al.，2010;Pelosi et al.，2013）。在原始卵泡和初級卵泡階段，FoxO3主要分布在卵核內，當卵泡進入次級卵泡階段，其消失在卵核內而出現在卵泡邊緣，暗示FoxO3可能與原始卵泡的激活存在密切聯系。此外，在小鼠上通過基因敲除和轉基因等手段進一步證實FoxO3基因在原始卵泡激活過程中起調控開關作用（John et al.，2008;Pelosi et al.，2013）。但至今有關FoxO3在禽類卵泡激活及發育方面的研究鮮見報道。

本研究結果表明，在0日齡雞卵巢組織中能檢測到FoxO3基因表達，且其相對表達量顯著高于在21日齡和成年雞卵巢組織中的相對表達量，但免疫熒光檢測未發現FoxO3蛋白，可能是由于0日齡雞卵巢組織中的原始卵泡尚未激活，原始卵泡的生理活動較弱，其轉錄的mRNA并非直接翻譯成蛋白而行使生物學功能，而是儲存在細胞中為后續的卵泡激活抑制做準備。在21日齡雞卵巢組織中，FoxO3基因相對表達量雖然顯著低于0日齡雞卵巢組織，但此時雞卵巢組織中已出現FoxO3蛋白，且主要分布在原始卵泡周圍的顆粒細胞中，而不是存在于原始卵泡內。因此，推測FoxO3在家禽卵巢組織中具有抑制原始卵泡激活，以維持卵巢庫存量的作用。大量未激活的原始卵泡聚集在一起構成原始卵泡池，而原始卵泡池大小是衡量雌性動物生育能力的一個重要指標，是生殖壽命的近似決定因素（McGee and Hsueh，2000）。說明FoxO3可能與家禽的產蛋性能直接相關，尤其是蛋雞的產蛋周期和終生產蛋量。此外，在成年家禽中FoxO3蛋白存在于卵母細胞的外圍細胞質中，說明FoxO3由卵泡核向胞質轉移，與在哺乳動物上的研究結果（Pelosi et al.，2013）一致，同時暗示FoxO3在禽類卵母細胞的成熟與發育過程中發揮重要作用。FoxO3蛋白在不同發育階段雞卵巢組織中的定位差異則說明FoxO3在卵泡發育不同階段發揮不同功能作用。由于禽類和哺乳動物的FoxO3氨基酸序列高度同源（對應相似性均在78.0%以上），且FoxO3蛋白在家禽卵巢組織中的定位與在哺乳動物卵巢組織中的定位相似，因此推測FoxO3在家禽中發揮著與哺乳動物相似的功能。

本研究對FoxO3基因在雞卵巢組織中的定位及表達模式進行探究，為后續開展家禽卵泡激活及發育調控等相關機理研究提供了科學依據，即有望通過控制FoxO3來提高雞的繁殖性能。至今，關于FoxO3調控動物原始卵泡激活的作用機理尚未完全明確。雖然已確定FoxO3是調控原始卵泡激活的重要開關，但其開關作用受何種信號啟動仍未知，且FoxO3是直接主動控制觸發卵母細胞生長還是通過間接作用方式促進卵泡活化也未明確。現有針對FoxO3功能的研究主要集中在人類（Wang et al.，2010）及小鼠（Castrillon et al.，2003）、豬（Matsuda et al.，2012）和牛（Bromfield and Sheldon，2013）等哺乳動物上，而有關FoxO3對于鳥類、爬行動物及水生動物等的具體功能仍有待進一步探究。

4 結論

由于雞和哺乳動物的FoxO3氨基酸序列高度同源，且FoxO3蛋白在雞卵巢組織中的定位與在哺乳動物卵巢組織中的定位相似，說明FoxO3在雞卵巢組織中發揮著與哺乳動物相似的功能，即在卵泡激活與成熟過程中發揮重要作用，因此通過調控FoxO3能有效提高雞的繁殖性能。

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（責任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2019-09-17

基因項目：國家自然科學基金項目（31960157）

作者簡介：*為通訊作者，陸陽清（1976-），博士，研究員，博士生導師，主要從事干細胞及動物繁殖生物技術研究工作，E-mail：38360218@qq.com。洪永興（1994-），研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：455842143@qq.com