雞BRD2亞細胞定位及其組織表達特性分析

韓一帆　周磊　袁超　高洪波　王燕碧　趙采芹　唐宏　段志強

摘要：【目的】明確含溴結構域蛋白2（BRD2）的亞細胞定位及其表達特征，為后續研究BRD2基因調控雞組織發育的作用機制提供參考依據?！痉椒ā客ㄟ^構建雞BRD2基因重組真核表達載體pEGFP-BRD2，轉染人胚胎腎細胞（HEK-293T）后檢測重組蛋白EGFP-BRD2的表達情況及亞細胞定位;利用實時熒光定量PCR分別檢測雞胚14胚齡（E14 d）、雞出殼后1日齡（1 d）、7日齡（7 d）和14日齡（14 d）4個時間點各組織中BRD2基因的表達情況。【結果】重組真核表達載體pEGFP-C1-BRD2轉染HEK-293T細胞獲得的融合蛋白EGFP-BRD2約115.00 kD，且主要定位在細胞核。實時熒光定量PCR檢測結果表明，雞BRD2基因在E14 d和1 d肌胃中的相對表達量最高，在7和14 d肺臟中的相對表達量最高。BRD2基因在各組織的表達規律為：在眼球內E14 d到14 d的表達先下降后趨于穩定;在腦組織和心臟內的表達在E14 d至14 d間呈先下降后上升的變化趨勢;在肝臟內E14 d表達穩定，1 d后開始逐漸增加，至14 d時達最高值;在肺臟中E14 d的表達下降，1 d后急劇上升，至14 d時達最高值;在肌胃和胸肌中，均在7 d時最高，1 d時最低，E14 d和14 d時有較高表達，整體上呈倒N表達模式;在腿肌中，從E14 d到1 d表達減少，而后略有增加，7 d后開始下降，至14 d時降到最低值?！窘Y論】雞BRD2基因重組真核表達載體能在HEK-293T細胞中正確表達，且融合蛋白主要定位在細胞核;BRD2基因在雞不同發育階段的各組織中均有表達，但其表達量呈現不同的變化趨勢。

關鍵詞： 雞;含溴結構域蛋白2（BRD2）;亞細胞定位;表達規律;組織發育

中圖分類號： S831.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1857-07

Subcellular localization of chicken bromodomain-containing protein 2（BRD2） and its expression characteristics

HAN Yi-fan， ZHOU Lei， YUAN Chao， GAO Hong-bo， WANG Yan-bi，

ZHAO Cai-qin， TANG Hong， DUAN Zhi-qiang*

（College of Animal Sciences， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountains Region， Ministry of Education/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and

Reproduction in Guizhou， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】This study aimed to investigate the subcellular localization of chicken（Gallus gallus） bromodomain-containing protein 2 （BRD2）and analyze its expression characteristics in different tissues of chickens， which could provide the reference for subsequent research on the mechanism of BRD2 gene regulating chicken tissue development.【Method】The recombinant eukaryotic expression vector PEGFP-BRD2 of chicken BRD2 gene was constructed and transfected into human embryonic kidney cells（HEK-293T）. The expression and subcellular localization of the recombinant protein EGFP-BRD2 were examined by Western blot and inverted fluorescence microscope，respectively. In addition，real-time fluorescence quantitative? PCR（qRT-PCR）was used to detect the expression patterns of BRD2 gene in different tissues at chicken embryo 14 days（E14 d），1-day-old（1 d），7-day-old（7 d），and 14-day-old（14 d）. 【Result】The results showed that pEGFP-C1-BRD2 transfected HEK-293T cells，and the obtained fusion protein EGFP-BRD2 was about 115.00 kD and localized mainly in the nucleus. The qRT-PCR results showed that BRD2 gene had the highest relative expression in the stomach of chicken at E14 d and 1 d，and the lung at 7 d and 14 d. The expression pattern of BRD2 gene in various tissues revealed that the expression of BRD2 gene in the eye ball was first decreased and then stabilized from E14 d to 14 d，while in the brain and heart between E14 d to 14 d showed a trend from decline to increase. As for the liver and lung， it showed the stable expression in the liver on E14 d， gradually increased after 1 d and reached the peak on 14 d; it decreased expression in the lung at E14 d，? began to increase sharply after 1 d and reached the highest level at 14 d. In the stomach and pectoral muscle， the expression pattern of BRD2 gene was inverted N，showing that it was the highest at 7 d and the lowest at 1 d，but had? ?high expression at E14 d and 14 d. However，in leg muscles， the expression of BRD2 decreased from the E14 d to 1 d， then increased slightly， and began to decrease at 7 d and reached the lowest level at 14 d.【Conclusion】The chicken BRD2 gene recombinant eukaryotic expression vector is correctly expressed in HEK-293T cells and the fusion protein is mainly located in the nucleus. The qRT-PCR result shows that the chicken BRD2 gene is expressed in various tissues at different stages of chicken development， but its expression level shows different trends.

Key words： chicken; bromodomain-containing protein 2（BRD2）; subcellular localization; expression regulation; tissue development

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960698，31760732）; Guizhou Science and Technology Planning Project（QKHPTRC〔2017〕5788）

0 引言

【研究意義】含溴結構域蛋白2（Bromodomain-containing protein 2，BRD2）又稱RING3（Really inte-resting new gene 3 protein）（Denis and Green，1996），是一種能特異性識別乙?；嚢彼釟埢谋Ｊ氐鞍祝哂?個串聯的N-末端溴結構域（Bromodomain，BD）和1個保守的C-末端外結構域（Extra-terminal domain，ET）。其中，BD結構域是組蛋白乙酰轉移酶的結構模塊，也是唯一可識別和結合發生組蛋白乙酰化賴氨酸殘基的結構域（Sanchez and Zhou，2009）;而ET結構域是轉錄復合物與乙?；M蛋白結合為基因轉錄的主要調節器。BRD2在基因表達和表觀遺傳方面發揮重要作用，可調節轉錄水平（Peterson and Laniel，2004），參與細胞周期過程。因此，對雞BRD2基因進行表達及相關分析可為后續研究BRD2基因調控雞組織發育的作用機制打下基礎?！厩叭搜芯窟M展】BD結構域是一種在物種進化上高度保守的結構域，最早由Tamkun等（1992）發現并定名，一般由60～110個高度保守的氨基酸殘基組成，其中含有4個反向平行的α-螺旋（αZ、αA、αB和αC），通過2個可變柔性環狀結構（Variable-loop）將這4個α-螺旋兩兩相連，第一個環狀結構連接αZ和αA，因此被稱為ZA loop，另一個環狀結構連接αB與αC，而被稱為BC loop;ZA loop和BC loop結合成一個左旋結構域，幾個α-螺旋的末端2個環狀結構共同組成與核小體組蛋白中乙?；嚢彼嵯嗷プ饔玫氖杷诖‵ilippakopoulos et al.，2012）。由于BD結構域可識別和結合組蛋白乙?；馁嚢彼?，因此BRD2也是表觀遺傳領域研究的主要方向之一（Ferri et al.，2016）。已有研究表明，BRD2在果蠅（Drosophila melanogaster）、小鼠（Mus musculus）及人類（Homo sapiens）的胚胎生長發育過程中起重要調控作用，特別是在神經系統的發育過程中作用較明顯，如BRD2基因在神經系統胚胎早期的發育過程中呈高度表達，當神經元增殖后，BRD2基因能利用基因調控的方式豐富新生神經元細胞種類（Crowley et al.，2004）。張學思（2015）對成年小鼠的大腦皮質進行研究時發現BRD2基因主要表達于神經元中，同樣提示BRD2對成年動物神經元發育起調控作用。BRD2蛋白參與抗原呈遞加工、調控免疫應答、誘導免疫反應和抑制細胞活性等免疫調節（Taniguchi，2016）。BRD2蛋白可作為轉錄調節因子通過調節相關細胞周期蛋白，如Cyclin A、Cyclin E和Cyclin D及激活E2F轉錄因子等調控細胞周期（Sinha et al.，2005）。此外，BRD2被認為與多種疾病有關，如與青少年肌陣攣性癲癇相關（Pathak et al.，2018），在慢性炎癥和胰島素抵抗中發揮作用（Sun et al.，2017），或抑制BRD2表達可阻止部分腫瘤的發展（Sherman et al.，2017;周曉和程志祥，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】雞BRD2基因位于雞16號染色體主要組織相容性復合體（MHC）中MHC-B的核心區域（Miller et al.，1996），屬于MHC-Ⅱ類分子，與機體免疫調控相關。目前，有關BRD2的研究主要集中在人類和小鼠，對果蠅也有一些研究，但雞BRD2基因克隆、亞細胞定位及其在雞發育過程不同組織中的表達特征尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】通過克隆雞BRD2基因并構建其重組真核表達載體pEGFP-BRD2，轉染人胚胎腎細胞（HEK-293T）進行表達與亞細胞定位分析;并通過實時熒光定量PCR檢測BRD2基因在雞不同發育階段不同組織中的表達情況，為后續研究BRD2基因調控雞組織發育的作用機制提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 供試動物

SPF受精雞蛋購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司，在實驗室自行孵化。在雞胚發育第14 d（E14 d）及出殼后第1 d（1 d）、第7 d（7 d）和第14 d（14 d）4個時期各隨機選取3枚雞胚或3只小雞，分別采集眼球、腦組織、心臟、肝臟、肺臟、肌胃、胸肌和腿肌8個組織樣品，保存于-80 ℃用于總RNA提取。

1. 2 細胞、載體和試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態細胞、真核表達載體pEGFP-C1、HEK-293T細胞由貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室保存提供。組織RNA提取試劑盒購自OMEGA公司;2×Realstar Green Fast Mixture、DL5000 DNA Marker和反轉錄試劑盒購自北京康潤誠業生物科技有限公司;質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Axy-Gen公司;質粒小量提取試劑盒購自QIAGEN公司;限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ及DNA高保真聚合酶購自Thermo Fisher公司;DMEM高糖培養基和胎牛血清購自Gibco公司;FuGENE?HD Transfection Rea-gent購自Promega公司;1×RIPA細胞裂解液（弱）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）、30% Acr-Bis（29∶1）、預染蛋白質分子量標準和超敏ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術研究所;HRP標記的抗GFP鼠單克隆抗體購自Proteintech公司。

1. 3 引物合成

根據雞BRD2基因（GenBank登錄號XM_01529 4960）核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0設計雞BRD2基因的PCR擴增引物和實時熒光定量PCR擴增引物，以雞GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因作為內參基因。所有引物（表1）均委托昆泰銳（武漢）生物技術有限責任公司合成。

1. 4 重組真核表達載體pEGFP-BRD2構建

以雞胚成纖維細胞總RNA反轉錄后的cDNA為模板，利用特異性引物BRD2-F/BRD2-R擴增BRD2基因。PCR反應體系25.0 μL：cDNA模板4.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.0 μL，MgSO4 1.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Pfu Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 40 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min。膠回收后的PCR產物和真核表達載體pEGFP-C1分別用XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，膠回收目的片段后進行連接，將轉化產物涂布在含卡那霉素的LB培養基上。挑取單菌落擴大培養，首先采用菌液PCR進行鑒定，然后提取疑似陽性菌質粒并進行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒送至重慶擎科興業生物技術有限公司測序。

1. 5 融合蛋白表達分析

將HEK-293T細胞接種于6孔細胞培養板內進行培養，等待細胞匯合度達80%左右時，采用脂質體轉染法對pEGFP-BRD2和pEGFP-C1分別進行轉染。至轉染后36 h，用1×RIPA細胞裂解液對細胞進行裂解，并于4 ℃下離心收集上清液，加入適量蛋白上樣緩沖液處理后進行SDS-PAGE，將蛋白轉印至PVDF膜上。PVDF膜在4 ℃下使用5%脫脂乳封閉2 h，加入經1∶12000稀釋的HRP標記的抗GFP鼠單克隆抗體在4 ℃下孵育過夜，隨后用TBST洗滌3次，使用ECL化學發光試劑盒進行顯色并拍照。

1. 6 融合蛋白亞細胞定位分析

將培養的HEK-293T細胞接種于6孔細胞培養板進行培養，待細胞密度達80%左右，采用脂質體轉染法將pEGFP-BRD2和pEGFP-C1分別轉染HEK-293T細胞，培養24 h后棄6孔板中的細胞培養液，PBS浸洗3次;加入4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS浸洗3次;加入0.25% TritonX-100室溫破膜5 min，PBS浸洗3次;加入DAPI避光孵育5 min，PBS浸洗3次，最后置于倒置熒光顯微鏡下采集圖片。熒光圖片用Photoshop CS5進行Merge處理。

1. 7 總RNA提取及cDNA合成

根據OMEGA試劑盒說明分別提取4個時期雞眼球、腦組織、心臟、肝臟、肺臟、肌胃、胸肌和腿肌的總RNA并進行反轉錄。反轉錄過程按照北京康潤誠業生物科技有限公司反轉錄試劑盒說明進行操作。反應體系20.0 ?L：1000 ng/?L RNA模板1.0 ?L、50 ?mmol/L Oligo dT Primer 1.0 ?L、DEPC-ddH2O 7.0 ?L、2×Reaction Mix 10.0 ?L、StarScript II RT Mix 1.0 ?L。反應條件：65 ℃ 5 min;42 ℃ 50 min;85 ℃ 5 min。

1. 8 BRD2基因在雞不同發育階段各組織中的表達分析

以反轉錄合成的cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR檢測BRD2基因在雞發育不同階段不同組織中的表達情況。反應體系20.0 ?L：2×Realstar Green Fast Mixture 10.0 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.5 ?L，cDNA模板1.0 ?L，ddH2O 8.0 ?L。擴增程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃ 15 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，40個循環后進行熔解曲線分析，溫度以5 ℃/s的速率從65 ℃遞增至95 ℃。

1. 9 統計分析

運用2-ΔΔCt法對實時熒光定量PCR檢測數據進行計算分析。具體公式為：ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，選取眼球組織為對照，計算各組織樣品的ΔΔCt值，運用2-ΔΔCt對目的基因的相對表達量進行計算，并利用SPSS 18.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2. 1 重組真核表達載體pEGFP-BRD2鑒定結果

以雞胚成纖維細胞總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，利用特異性引物成功擴增得到與預期大小相符的雞BRD2基因條帶（圖1-A）。將PCR產物膠回收后與真核表達載體pEGFP-C1分別進行雙酶切，再次進行膠回收、連接和轉化，然后在含卡那霉素的LB培養基上挑取單菌落進行擴大培養，經菌液PCR鑒定，鑒定正確的菌液提取質粒，通過雙酶切鑒定分別得到4700 bp左右的載體條帶和2340 bp的目的基因條帶（圖1-B）。測序結果顯示，雞BRD2基因正確插入到真核表達載體pEGFP-C1中，未發生閱讀框的移碼和基因突變，表明重組真核表達載體pEGFP-BRD2構建成功。

2. 2 融合蛋白表達分析結果

為了解融合蛋白EGFP-BRD2在HEK-293T細胞中是否正確表達，利用Western blotting對其進行檢測。結果（圖2）顯示，重組真核表達載體pEGFP-BRD2轉染HEK-293T細胞后可獲得大小為115.00 kD左右的目的蛋白條帶，與預估結果（EGFP為28.00 kD，BRD2為85.66 kD）相符合;而空載體pEGFP-C1轉染HEK-293T細胞后獲得的蛋白條帶位于28.00 kD附近，說明融合EGFP-BRD2在HEK-293T細胞中成功表達。

2. 3 融合蛋白亞細胞定位分析結果

為了解融合蛋白EGFP-BRD2在細胞中的亞細胞定位情況，將重組真核表達載體pEGFP-BRD2和空載體pEGFP-C1分別轉染HEK-293T細胞，利用倒置熒光顯微鏡觀察融合蛋白的細胞熒光。結果（圖3）顯示，EGFP蛋白呈綠色熒光，DAPI染核后呈藍色熒光，兩者不完全重合;而融合蛋白EGFP-BRD2呈現的綠色熒光與DAPI染核的藍色熒光完全重組，表明融合蛋白EGFP-BRD2定位在細胞核。

2. 4 BRD2基因在雞不同發育階段各組織中的表達規律分析結果

采用實時熒光定量PCR檢測雞BRD2基因在E14、1、7和14 d各組織中的相對表達量，探究BRD2基因在雞不同發育階段各組織中的表達規律。結果（圖4）表明，雞BRD2基因在E14 d的各組織中均有表達，其中肌胃中的相對表達量最高，肝臟中的相對表達量最低，各組織相對表達量排序為：肌胃>肺臟>眼球>心臟>腿肌>腦組織>胸肌>肝臟;在1 d的各組織中，BRD2基因在肌胃中的相對表達量最高，胸肌中的相對表達量最低，各組織相對表達量排序為：肌胃>眼球>肺臟>肝臟>腿肌>心臟>腦組織>胸肌;在7 d的各組織中，BRD2基因在肺臟中的相對表達量最高，且顯著高于其他組織（P<0.05，下同），其次是肌胃，在腦組織中的相對表達量最低，各組織相對表達量排序為：肺臟>肌胃>肝臟>胸肌>心臟>眼球>腿肌>腦組織;在14 d的各組織中，BRD2基因在肺臟中的相對表達量最高，顯著高于其他組織，在肝臟中的相對表達量其次，胸肌中的相對表達量最低，各組織相對表達量排序為：肺臟>心臟>肝臟>肌胃>眼球>腦組織>腿肌>胸肌。

對雞BRD2基因在不同發育階段各組織中的表達規律進行分析，結果（圖5）顯示，從E14 d到14 d，BRD2基因在眼球內的表達先下降后趨于穩定;在腦組織和心臟的表達呈先下降后上升的變化趨勢;在E14 d的肝臟內表達穩定，從1 d開始逐漸增加，至14 d時達最高值;在肺臟中表現為1 d后急劇上升，至14 d時達最高值;在肌胃和胸肌中均在7 d時最高，1 d時最低，E14 d和14 d時有較高表達，整體表達呈倒N模式;在腿肌中，BRD2基因從E14 d到1 d的表達減少，而后略有增加，7 d之后開始下降，在14 d時降至最低值。

3 討論

含溴結構域蛋白共分為8個亞族，BRD2是第二亞族（Sub-family II）溴結構域和超末端結構域（Bromodomain and extra-terminal domain，BET）蛋白家族成員（Lloyd and Glass，2018）。作為BET家族成員之一，BRD2蛋白具有2個串聯的N-末端BD結構域和1個保守的C-末端外ET結構域。BET成員雖具有相似結構，但各成員間的生物學功能存在一定差異。已有研究表明，BRD2通過在體內外與組蛋白H4第12位乙酰化的賴氨酸結合（Kanno et al.，2004），作為“讀者”（Reader）參與乙?；揎椷^程。乙酰化修飾作為一種翻譯后修飾調控機制在細胞核或細胞質的亞細胞器內廣泛存在（楊雨薇等，2019）。相關研究表明，人類的BRD2蛋白存在于細胞核內（Denis and Green，1996），小鼠的BRD2蛋白也位于細胞核中（Guo et al.，2000）。本研究通過將BRD2基因插入真核表達載體pEGFP-C1中，構建重組真核表達載體pEGFP-BRD2，并轉染HEK-293T細胞進行表達，結果發現融合蛋白EGFP-BRD2主要定位在細胞核，而EGFP蛋白定位在細胞核和細胞質中，表明雞BRD2蛋白存在于細胞核內。此外，通過核定位信號預測及與已報道的人類BRD2蛋白核定位信號氨基酸序列比對分析，發現雞BRD2蛋白核定位信號位于500KKKKKKSEKHK510，為后續研究雞BRD2蛋白細胞核定位的分子機制提供了基礎。

在果蠅、小鼠和人類的生長發育相關研究中，發現BRD2同樣發揮重要的調控作用，在神經系統發育過程中BRD2基因會在增殖的神經元祖細胞中表達，細胞周期表現刺激活性，過量表達時會抑制神經元的分化（Garcia-gutierrez et al.，2014）。在已分化的神經元細胞中也能檢測到BRD2基因表達。當大腦內所需關鍵神經元細胞減少則會導致BRD2不足（Velí?ek et al.，2011），若BRD2發生缺失，將會引起神經前體細胞的增殖變多，嚴重者會導致神經管延遲閉合（Gyuris et al.，2009），甚至是胚胎的早期死亡（Shang et al.，2009）。通過人類、小鼠和斑馬魚的研究發現，BRD2基因在卵巢、睪丸、卵子、早期胚胎和神經系統發育時高度表達（Rhee et al.，1998;Dibenedetto et al.，2008; Shang et al.，2009），且在體內其他組織中也均有表達（Shang et al.，2009），但表達量在不同發育階段有所不同。

本研究通過實時熒光定量PCR檢測BRD2基因在雞生長發育過程中的表達規律，結果發現BRD2基因在眼球內的表達先下降后趨于穩定，雞眼球中包括鞏膜、角膜、血管膜、睫狀體、晶狀體、玻璃體、視網膜等，其中視網膜上最后一根神經已達視頂蓋（劉黎和蘇國輝，1988），其后眼部神經發育基本完全，BRD2基因表達也與這一過程基本一致;BRD2在雞腦組織中的表達呈先下降后上升的變化趨勢，但其變化幅度不明顯，可能與腦組織神經的發育有關，E14 d后大腦皮質功能就已出現分區、小腦溝回增多，E20 d時大腦組織發育較快（阿依木古麗等，2011），BRD2基因表達處于較穩定的狀態;E8 d時雞胚的心臟已基本發育完成（張月娟，2004），BRD2基因在心臟的表達與在腦組織的表達規律基本一致;1 d前BRD2基因在肝臟的表達較穩定，1 d后開始逐漸增加，可能是由于肝臟可再生，BRD2蛋白可調節肝細胞再生過程（Russell et al.，2018）;BRD2基因在肺臟中1 d前表達逐漸下降，1 d后急劇上升，在肌胃中BRD2基因表達整體上呈倒N表達模式，雖未有相關研究證實BRD2與二者生長發育有相關聯系，但有研究表明BRD2與肺癌、胃癌有聯系（Riveiro et al.，2016;Chen et al.，2019）;在胸肌中的表達亦呈倒N模式，BRD2基因在腿肌中的表達呈先下降后上升再下降的模式，二者雖未有相關研究表明與BRD2的相關性，但從相關表現上來看1 d后有一定程度的上升可能與免疫調控相關。可見，本研究為后續揭示BRD2基因調控雞相關組織發育的作用機制打下了基礎。

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（責任編輯 王 暉）

收稿日期：2020-02-19

基金項目：國家自然科學基金項目（31960698，31760732）;貴州省科技計劃項目（黔科合平臺人才〔2017〕5788號）

作者簡介：*為通訊作者，段志強（1985-），博士，副教授，主要從事家禽抗病育種與疫病防控研究工作，E-mail：zqduan@gzu.edu.cn。韓一帆（1996-），研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：715709631@qq.com