品種、冷凍速率和白藜蘆醇對雞精液冷凍保存效果的影響

喻宗崗　蔣雋　朱立軍　姚亞鈴　蒲學慧　燕海峰

摘要：【目的】明確品種、冷凍速率和白藜蘆醇對雞精液冷凍保存效果的影響及其互作關系，為解決雞精液冷凍保存不穩定的困境及加快新品種培育進程提供技術支持。【方法】采集黑絲羽烏骨雞（簡稱烏雞）和黃土二雞（簡稱黃雞）2個品種的公雞精液，分別添加0、25、50和100 μmol/L白藜蘆醇，以二甲基乙酰胺（DMA）為抗凍劑制備細管凍精，在液氮面上1 cm處（高冷凍速率）或3 cm處（低冷凍速率）冷凍，通過凍后精子活力、脂質過氧化水平和線粒體膜電位水平評價雞精液凍后品質。【結果】黃雞精液凍后精子活力顯著高于烏雞（P<0.05，下同），但線粒體膜電位水平差異不顯著（P>0.05，下同）;高冷凍速率下的雞精液凍后脂質過氧化水平顯著低于低冷凍速率，但凍后精子活力和線粒體膜電位水平差異不顯著;不同白藜蘆醇添加量下，雞精液凍后精子活力和脂質過氧化水平差異不顯著，但線粒體膜電位水平差異顯著。雙因素組合時，品種×冷凍速率、品種×白藜蘆醇和冷凍速率×白藜蘆醇間均存在交互作用，其中，烏雞×高冷凍速率組合的雞精液凍后脂質過氧化水平顯著低于黃雞×高冷凍速率組合，但凍后精子活力和線粒體膜電位水平無顯著差異。三因素組合時，雞精液凍后脂質過氧化水平最低的組合是烏雞×低冷凍速率×50 μmol/L白藜蘆醇，線粒體膜電位水平最高的組合是烏雞×低冷凍速率×0 μmol/L白藜蘆醇。【結論】雞精液冷凍保存時其品種、冷凍速率和白藜蘆醇間存在二元互作效應或三元互作效應。因此，只有充分考慮雞品種、冷凍速率和抗氧化劑間的互作效應，才能切實提高雞冷凍精液的品質。

關鍵詞： 雞;冷凍精液;品種;冷凍速率;白藜蘆醇;互作效應

中圖分類號： S831.34? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1880-08

Effects of breeding line， freezing rate and resveratrol on chicken semen cryopreservation

YU Zong-gang1，2， JIANG Juan1*， ZHU Li-jun2， YAO Ya-ling3， PU Xue-hui3，

YAN Hai-feng2*

（1College of Animal Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha? 410128， China; 2Hunan Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Changsha? 410131， China;? 3Xinhuang Gongxi Yelang Chicken Culture Professional Cooperative， Xinhuang， Hunan? 419200， China）

Abstract：【Objective】To clarify the effects of variety， freezing rate and resveratrol on the cryopreservation of chicken semen and their interaction， so as to provide technical support for solving the dilemma of unstable cryopreservation of chicken semen and speeding up the breeding process of new breeds. 【Method】Semen of two breeds， black-feathered black-bone chicken（abbreviated asblack chicken） and yellow two native chicken（abbreviated asyellow chicken）， were collected， added with resveratrol at 0， 25， 50 and 100 μmol/L， respectively， and made into thin tube frozen semen with dimethyl acetamide（DMA） as cryoprotectant， which was frozen at 1 cm （high freezing rate） or 3 cm （low freezing rate） on the surface of liquid nitrogen.The quality of frozen semen was evaluated by semen viability， lipid peroxidation level and mitochondrial membrane potential level after freezing. 【Result】The sperm vitality of yellow chicken after semen freezing was significantly higher than that of black chicken（P<0.05，the same below）， but there was no significant difference in mitochondrial membrane potential level（P>0.05， the same below）. The lipid peroxidation level of chicken semen at high freezing rate was significantly lower than that at low freezing rate， but there was no significant difference in sperm motility and mitochondrial membrane potential level after freezing. Under different resveratrol dosages， there was no significant difference in sperm vitality and lipid peroxidation level after chicken semen freezing， but there was significant difference in mitochondrial membrane potential level.When the two factors were combined， there were interactions among breeds×freezing rate， breeds×resveratrol and freezing rate×resveratrol. The lipid peroxidation level of semen in the combination of black chicken×high freezing rate was significantly lower than that in the combination of yellow chicken×high freezing rate， but there was no significant difference in sperm motility and mitochondrial membrane potential after free-zing. In the combination of three factors， the combination with the lowest lipid peroxidation level after semen freezing was black-bone chicken×low freezing rate×50 μmol/L resveratrol， and the combination with the highest mitochondrial membrane potential level was black-bone chicken×low freezing rate×0 μmol/L resveratrol. 【Conclusion】 There is binary interaction effect or ternary interaction effect among chicken semen variety， freezing rate and resveratrol during cryopreservation. Therefore， only by fully considering the interaction effect among chicken breeds， freezing rate and antioxidants can the quality of chicken frozen semen be effectively improved.

1. 2. 3 白藜蘆醇儲存液及工作濃度 準確稱量0.2282 g白藜蘆醇溶于10 mL二甲基亞砜（DMSO）中，制成100 mmol/L的儲存液，使用時分別取6、12和24 μL的儲存液溶于24 mL的LRD抗凍液中，即獲得25、50和100 μmol/L的工作液。

1. 3 試驗設計

采用2×2×4（雞品種×冷凍速率×白藜蘆醇）的完全隨機設計，將每個品種（烏雞和黃雞）采集到的混合精液分成4組，每組3個重復，每組添加不同濃度（0、25、50和100 μmol/L）的白藜蘆醇，然后將含不同濃度白藜蘆醇的精液細管置于液氮面上不同高度（1和3 cm）進行熏蒸和冷凍，解凍后檢測凍后精子活力、脂質過氧化水平和線粒體膜電位水平，以評估凍后精液質量。

1. 4 細管凍精制作

1. 4. 1 精液采集及現場稀釋 參照曹江麗（2017）的方法，采集11羽試驗公雞的精液置于集精管中，上下顛倒集精管使其充分混勻，然后以移液器將精液移至已消毒的EP管（100 mL）中，吸取1/2體積基礎稀釋液進行稀釋，并在10 min內將稀釋精液帶回實驗室。

1. 4. 2 鮮精檢測與平衡 吸取稀釋精液10 μL滴于30 ℃恒溫顯微鏡載物臺預熱的載玻片上進行精子活力和精液密度判斷。乳白色、無糞便污染且精子活力在0.8以上的鮮精用于制作凍精。將2個品種公雞的混合精液分別分成4等份，置于4 ℃雙制冷電子冰箱中平衡30 min。

1. 4. 3 抗凍液添加及平衡 采用稀釋精液與抗凍液等體積混合，即精液終稀釋比1∶3，然后置于4 ℃雙制冷電子冰箱中平衡10 min。參照高亞楠等（2019）建立的雞精子密度曲線，計算得到烏雞和黃雞的精液終密度分別為10.6525×108和13.3140×108個/mL。

1. 4. 4 細管制作、熏蒸、冷凍及保存 參見曹江麗（2017）的方法。

1. 5 細管凍精凍后品質檢測

1. 5. 1 凍精解凍及精子活力檢測 從液氮中取出的細管迅速置于40 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 s，用細管針從棉塞端將精液推出至已消毒的EP管中，使用移液槍吸取精液10 μL滴于30 ℃恒溫顯微鏡載物臺預熱的載玻片上，在10倍物鏡下進行眼觀精子活力判斷。

1. 5. 2 脂質過氧化水平檢測 采用MDA測試盒測定凍精脂質過氧化水平，其作用原理是過氧化脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸（TBA）結合形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰。MDA含量越高則精液脂質過氧化越嚴重，精液質量越差。嚴格按照MDA測試盒說明進行操作，樣品管、空白管和標準管均取液0.2 mL，水浴時間50 min，離心力6000 r/min;使用酶標儀測定吸光值，測定波長532 nm。計算公式如下：

MDA含量（nmol/mL）=（OD_測定-OD_空白/OD_標準-OD_空白）×10×3

1. 5. 3 線粒體膜電位水平檢測 采用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測精子線粒體膜電位水平。JC-1是一種廣泛應用于檢測線粒體膜電位?Ψm的理想熒光探針，通過熒光顏色的轉變即可檢測線粒體膜電位水平變化（李秀鵬等，2017）。制樣程序按照試劑盒說明進行操作，并對部分步驟進行調整，離心力6000 r/min，洗滌1次。使用全波長掃描式多功能讀數儀進行熒光強度測定，設雙熒光參數，第一激發波長490 nm，發射波長527 nm;第二激發波長525 nm，發射波長590 nm。最后以第二熒光強度值與第一熒光強度值的比值進行統計分析，紅綠熒光比值越高說明精液質量越好。

1. 6 統計分析

試驗數據錄入Excel 2020進行整理，以SPSS 19.0進行GLM單變量方差分析，若單變量方差分析差異顯著則進行LSD和Duncans多重比較。數學模型為：

x_ijlk=μ+α_i+β_j+γ_l+（αβγ）_ijl+（αβ）_ij+（αγ）_il+（βγ）_jl+ε_ijlk

式中，μ為總體平均數，α為雞品種（i=1，2）;β為冷凍速率效應（j=1，2），γ為抗氧化劑效應（l=1，2，3，4），αβγ為品種、冷凍速率和抗氧化劑的互作效應，αβ為雞品種和冷凍速率的互作效應，αγ為雞品種和抗氧化劑的互作效應，βγ為冷凍速率和抗氧化劑的互作效應，ε為隨機誤差效應，k為重復數。

2 結果與分析

2. 1 品種、冷凍速率和白藜蘆醇對雞精液凍后品質的影響

由表2可知，烏雞和黃雞的精液凍后精子活力和脂質過氧化水平存在顯著差異（P<0.05，下同），均表現為黃雞顯著高于烏雞，但其線粒體膜電位水平差異不顯著（P>0.05，下同）;不同冷凍速率下，雞精液冷凍后脂質過氧化水平差異顯著，高冷凍速率下的精液凍后脂質過氧化水平顯著低于低冷凍速率，但凍后精子活力和線粒體膜電位水平差異不顯著;不同白藜蘆醇添加水平下，雞精液凍后精子活力和脂質過氧化水平差異不顯著，但線粒體膜電位水平差異顯著，經LSD多重比較分析發現空白組的線粒體膜電位水平顯著高于各白藜蘆醇添加組，且25 μmol/L處理組顯著高于50和100 μmol/L處理組。

2. 2 品種、冷凍速率和白藜蘆醇兩兩組合對雞精液凍后品質的影響

由表3可知，不同品種的雞精液凍后精子活力均表現為高冷凍速率處理高于低冷凍速率處理，而脂質過氧化水平表現為高冷凍速率處理低于低冷凍速率處理。相同冷凍速率下黃雞精液凍后脂質過氧化水平均顯著高于烏雞;高冷凍速率下烏雞精液凍后線粒體膜電位水平高于黃雞，低冷凍速率下則烏雞精液凍后線粒體膜電位水平顯著低于黃雞。隨白藜蘆醇添加量的增加，烏雞精液凍后精子活力不斷升高，而脂質過氧化水平呈升高—降低—升高的變化趨勢，黃雞精液凍后精子活力和脂質過氧化水平均呈降低—升高—降低的變化趨勢;雞精液凍后線粒體膜電位水平整體上隨白藜蘆醇添加量的增加而降低。不同冷凍速率下，雞精液凍后精子活力整體上隨白藜蘆醇添加量的增加呈先降低后升高的變化趨勢;高冷凍速率下雞精液凍后脂質過氧化水平隨白藜蘆醇添加量的增加呈降低—升高—降低的變化趨勢，而低冷凍速率下的變化趨勢與高冷凍速率下的恰好相反;雞精液凍后線粒體膜電位水平整體上隨白藜蘆醇添加量的增加呈降低趨勢。

差異顯著性檢驗結果顯示，雞精液凍后精子活力在品種×白藜蘆醇互作時差異顯著，但在其他兩種組合互作時差異不顯著;脂質過氧化水平和線粒體膜電位水平在品種、冷凍速率和白藜蘆醇的雙因素組合互作中均差異顯著。

2. 3 品種、冷凍速率和白藜蘆醇三因素組合對雞精液凍后品質的影響

由表4可知，高冷凍速率下烏雞精液凍后精子活力隨白藜蘆醇添加量的增加呈升高—降低—升高的變化趨勢，脂質過氧化水平的變化趨勢恰好相反，呈降低—升高—降低的變化趨勢，而線粒體膜電位水平呈逐漸降低趨勢;低冷凍速率下烏雞精液凍后精子活力隨白藜蘆醇添加量的增加而逐漸升高，脂質過氧化水平呈升高—降低—升高的變化趨勢，線粒體膜電位水平則呈先降低再升高的變化趨勢。高冷凍速率下黃雞精液凍后精子活力、脂質過氧化水平及線粒體膜電位水平均隨白藜蘆醇添加量的增加而呈降低—升高—降低的變化趨勢;低冷凍速率下黃雞精液凍后精子活力也隨白藜蘆醇添加量的增加呈降低—升高—降低的變化趨勢，脂質過氧化水平整體上呈逐漸降低趨勢，線粒體膜電位水平則呈升高—降低—升高的變化趨勢。

三因素互作分析結果顯示，各組合間的雞精液凍后精子活力差異不顯著，但脂質過氧化水平和線粒體膜電位水平差異極顯著（P<0.01）。Duncan?s多重比較分析結果表明，雞精液凍后脂質過氧化水平最低的組合是烏雞×低冷凍速率×50 μmol/L白藜蘆醇，線粒體膜電位水平最高的組合是烏雞×低冷凍速率×0 μmol/L白藜蘆醇，即烏雞精液在低冷凍速率下添加低劑量白藜蘆醇可獲得較好的冷凍效果。

3 討論

3. 1 雞冷凍精液品質影響因素

精液凍存是利用生物的休眠原理，但降溫產生的冰晶會對精子細胞產生理化損傷。冷凍速率決定冰晶形成的大小，一般是通過改變精液在液氮面上的熏蒸距離來實現冷凍速率調控，不同學者采用的熏蒸距離也各不相同。Long等（2014）采用1.25 cm，Kowalczyk和Lukaszewicz（2015）采用2 cm，Mosca等（2016）采用3 cm，Longobardi等（2017a）采用4 cm，Mameddu等（2016）采用5 cm，Abouelezz等（2017）采用7 cm，Chuaychu-Noo等（2017）采用11 cm。不同冷凍速率通過胞內外化學勢能平衡來決定冰晶形成的大小，進而控制對精子的損傷程度（喻宗崗等，2019）。本研究結果表明，高冷凍速率（液氮面上1 cm）能更好地保護雞冷凍精液，獲得較低的脂質過氧化水平。公雞生殖系統由于缺乏副性腺分泌的糖類及檸檬酸等物質，因此雞精液中缺少維持供能物質，且精子膜含有大量多不飽和脂肪酸，在體外制作凍精過程中接觸ROS的概率明顯增加，更易被氧化（喻宗崗等，2019）。

已有大量研究表明，改變冷凍速率并向精液中添加抗氧化物可有效提高凍精品質。在人類（Garcez et al.，2010;Nashtaei et al.，2018）及鼠（Silva et al.，2012）、羊（Silva et al.，2014）、豬（王昕，2015）和水牛（Longobardi et al.，2017b）的精液基礎稀釋液中添加白藜蘆醇，其平均凍精活力與鮮精活力無顯著差異。本研究結果也表明，在不同白藜蘆醇添加水平（0～100 μmol/L）下，雞精液凍后精子活力和脂質過氧化水平差異不顯著，但線粒體膜電位水平差異顯著，且整體上隨白藜蘆醇添加量的增加呈降低趨勢，與李世佳等（2018）在人類凍精中的研究結果存在差異，究其原因可能是哺乳動物與鳥類生殖系統的差異所致。白藜蘆醇的有效抗氧化成分是親脂性非黃酮類多酚化合物，其通過防止和清除ROS而發揮抗氧化作用。在本研究中，由于冷凍速率與白藜蘆醇間存在互作效應，使用單因素分析不足以解釋其互作效應，因此對各因素水平進行Duncan?s多重比較，結果顯示高冷凍速率下添加25 μmol/L白藜蘆醇的雞精液凍后脂質過氧化水平最低。

Feyisa等（2017）研究發現地方種雞的精液抗凍性存在明顯差異。本研究結果表明，黃雞精液凍后精子活力顯著高于烏雞，但脂質過氧化水平也顯著高于烏雞。此外，本研究首次發現品種、冷凍速率和抗氧化劑間存在互作效應，Duncan?s多重比較分析結果表明，在品種×冷凍速率組合中，平均凍后精子活力最高、脂質過氧化水平最低及線粒體膜電位水平最高的組合分別是黃雞×高冷凍速率、烏雞×高冷凍速率和黃雞×低冷凍速率，其原因可能是不同品種公雞的精液組分種類和含量存在差異，且不同冷凍速率下精液降溫速度不同，導致精液中形成的冰晶數量和大小也不同，差異化的精子損傷程度致使精液凍后品質不同。在品種×白藜蘆醇組合中，平均凍后精子活力最高、脂質過氧化水平最低及線粒體膜電位水平最高的組合分別是黃雞×0 μmol/L白藜蘆醇、烏雞×50 μmol/L白藜蘆醇和烏雞×0 μmol/L白藜蘆醇，可能是不同品種公雞的精液組分種類和含量差異導致白藜蘆醇滲透效率不同，而導致白藜蘆醇的抗氧化活性存在差異。在冷凍速率×白藜蘆醇組合中，脂質過氧化水平最低及線粒體膜電位水平最高的組合分別是高冷凍速率×25 μmol/L白藜蘆醇和低冷凍速率×0 μmol/L白藜蘆醇。不同冷凍速率下相同白藜蘆醇濃度與同一冷凍速率下不同白藜蘆醇濃度的滲透和交換效率均不同，導致精液中形成的冰晶及白藜蘆醇的抗氧化活性存在差異，最終影響冷凍精液品質。在品種×冷凍速率×白藜蘆醇組合中，脂質過氧化水平最低及線粒體膜電位水平最高的組合分別是烏雞×低冷凍速率×50 μmol/L白藜蘆醇和烏雞×低冷凍速率×0 μmol/L白藜蘆醇，是白藜蘆醇濃度決定抗氧化活性、冷凍速率決定冰晶大小和數量、品種決定雞精液組分含量和種類，共同影響精液抗凍性的結果。

3. 2 雞冷凍精液品質評定標準

凍后精子活力是評價冷凍精液品質的重要指標之一，凍后精子活力高低直接影響其受精能力。眼觀活力由于便捷而被廣泛應用，但其準確性依賴于檢測人員的經驗，且精子活力是一種較綜合的表觀體現，無法觀察到精子的超微結構變化及具體損傷部位。本研究結果表明，不同品種間的雞精液凍后精子活力差異顯著，與Feyisa等（2017）的研究結果一致，且品種×白藜蘆醇互作的凍后精子活力也存在顯著差異。雞精子膜上含有大量多不飽和脂肪酸，極易被ROS氧化而發生脂質過氧化反應。因此，通過脂質過氧化水平檢測可進一步評定冷凍后的雞精液品質。MDA是脂質過氧化反應的終產物，能間接反映精子的氧化損傷程度（王捷等，2018）。本研究結果表明，品種、冷凍速率、品種×冷凍速率互作、品種×白藜蘆醇互作、冷凍速率×白藜蘆醇互作及品種×冷凍速率×白藜蘆醇互作均顯著影響雞冷凍精液的脂質過氧化水平。

線粒體是細胞中制造能量的重要結構，其功能完整性決定著細胞的正常生理狀態，而膜電位水平可直接反映精子的獲能狀態。線粒體膜電位水平下降是細胞凋亡的早期信號（Bollwein et al.，2008），因此，通過線粒體膜電位水平檢測即可獲知精子的損傷程度。本研究發現，白藜蘆醇、品種×冷凍速率互作、品種×白藜蘆醇互作、冷凍速率×白藜蘆醇互作及品種×冷凍速率×白藜蘆醇互作均顯著影響雞冷凍精液的線粒體膜電位水平。此外，本研究選取綜合平衡法來確定最佳組合，通過極差確定因素的主次關系（品種>白藜蘆醇>冷凍速率），并按因素主次選取較優組合，最終確定烏雞精液在低冷凍速率下添加低劑量白藜蘆醇即可獲得較好的冷凍效果。

4 結論

雞精液冷凍保存時其品種、冷凍速率和白藜蘆醇間存在二元互作效應或三元互作效應。因此，只有充分考慮雞品種、冷凍速率和抗氧化劑間的互作效應，才能切實提高雞冷凍精液的品質。

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