番茄黃化曲葉病毒侵染危害海南番茄及其分子特征

湯亞飛　周洋　張麗　李正剛　佘小漫　于琳　藍國兵　鄧銘光　何自福

摘要：【目的】明確引起海南三亞、東方和陵水番茄黃化曲葉病的病毒分子特征，為防控該病害提供科學依據。【方法】以2019年2月從海南三亞、東方和陵水采集的15份疑似番茄黃化曲葉病樣本為材料，采用菜豆金色花葉病毒屬病毒的通用簡并引物AV494/CoPR對15份樣本進行PCR檢測，并對PCR檢測為陽性的樣本進行滾環擴增（RCA）及基因克隆，獲得侵染海南三亞、陵水和東方番茄的病毒基因組全序列，進而在GenBank數據庫BLASTh程序進行相似性比對，利用SDT 1.2的MUSCLE alignment進行序列相似性比較分析，采用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹，明確所獲得病毒分離物與已報道分離物的親緣關系。【結果】獲得侵染海南三亞、陵水和東方番茄的3個番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）分離物基因組全序列，其大小均為2781 nt，編碼6個開放閱讀框（ORF），其中病毒鏈上AV1和AV2基因，互補鏈上AC1、AC2、AC3和AC4基因。相似性比對分析結果表明，TYLCV海南分離物與墨西哥和美國分離物的相似性在99.0%以上，與來自我國不同省（市）的14個TYLCV分離物的相似性在98.0%以上。系統發育進化分析顯示，海南三亞、陵水和東方3個分離物與墨西哥、美國及我國北京和江蘇分離物聚集在一個小分支，進一步與來自我國其他12個省（市）、韓國、哥斯達黎加和澳大利亞的分離物形成一個分支。【結論】侵染海南番茄的TYLCV可能來自我國大陸的番茄等種苗和煙粉虱帶毒傳入，也有可能來自墨西哥和美國等其他國家。

關鍵詞： 番茄黃化曲葉病毒;分子鑒定;序列分析;海南

中圖分類號： S432.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1970-07

Tomato yellow leaf curl virus infecting tomato in Hainan

and its molecular characteristics

TANG Ya-fei1，2， ZHOU Yang3， ZHANG Li1， LI Zheng-gang1， SHE Xiao-man1，2，

YU Lin1， LAN Guo-bing1， DENG Ming-guang1， HE Zi-fu1，2*

（1Plant Protection Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou? 510640， China;? 2Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou? 510640， China;

3Agricultural Service Center of Dongfang， Dongfang， Hainan? 572600， China）

Abstract：【Objective】This study was to identify the molecular characterization of Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV） that caused tomato yellow leaf curl disease in Sanya， Dongfang and Lingshui of Hainan， in order to provide scientific basis for prevention and control of the disease in the area. 【Method】In February， 2019，15 suspected diseased tomato samples were collected from Sanya， Dongfang and Lingshui of Hainan. The 15 samples were detected by PCR using the universal degenerate primers AV494/CoPR for Begomoviruses. The PCR positive samples were amplified by rolling circle amplification（RCA） and cloned to obtain whole genome sequences of virus isolated from tomato in Sanya， Lingshui and Dongfang. These obtained sequences identity was compared and analyzed using BLAST on GenBank database. Pairwise nucleotide sequence identities were determined using SDT 1.2 with MUSCLE alignment. Phylogenetic? analysis was conducted using MEGA 6.0 with neighbor joining method to clarify the genetic relationship between isolates of obtained virus and the reported isolates. 【Result】Three whole genome sequences of TYLCV isolated from tomato in Sanya， Lingshui and Dongfang of Hainan were 2781 nucleotides （nt） long and encoded six open reading frames（ORFs）. The AV1 and AV2 were located on the virion sense DNA strand， whereas， the AC1， AC2， AC3， AC4 genes were located on the complementary sense strand. The results of identity comparison showed that TYLCV isolated from Hainan shared over 99.0% nt identities with Mexico isolate and USA isolate， and over 98.0% nt identities with the 14 isolates from different provinces or municipalities of China. The result of phylogenetic analysis showed that Sanya， Lingshui and Dongfang isolates clustered with isolates of TYLCV from Mexico， USA， Beijing and Jiangsu of China to form a unique clade， further clustered with all isolates from other 12 provinces or municipalities of China， South Korea， Costa Rica， Australia to form a clade. 【Conclusion】TYLCV infecting tomato in Hainan should come from other areas of China， or Mexico， the United States and other countries by transmitting through seedling and whitefly.

Key words： Tomato yellow leaf curl virus; molecular identification; sequence analysis; Hainan

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0201209）;Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation（2019A1515012150）;Guangzhou Science and Technology Project（201904010173）;Guangdong Modern Agricultural Common Key Technology Research and Develpment Innovation Team Building Project（2019KJ134）

0 引言

【研究意義】番茄（Solanum lycopersicum）是海南冬種北運蔬菜作物之一，年種植面積約6667 ha，主要分布在陵水、東方、昌江和定安等市（縣），是當地農民增收致富的重要經濟作物。番茄黃化曲葉病是全球番茄生產上一種毀滅性病害，已在熱帶亞熱帶地區造成嚴重損失（Hanssen et al.，2010）。2008年，海南省海口市發生番茄黃化曲葉病（Zhang et al.，2010），近年來在海南多個番茄產區暴發流行，已造成巨大經濟損失。因此，對引起海南番茄黃化曲葉病的病毒種類進行鑒定，明確其分子特征，可為該病毒病監測與防控提供依據，同時對促進海南番茄產業持續健康發展具有重要的指導意義。【前人研究進展】番茄黃化曲葉病是由煙粉虱傳播的雙生病毒侵染引起（朱曉林等，2019），但世界各地發生的番茄黃化曲葉病的病原病毒并不相同，國際上已報道可引起番茄黃化曲葉病的病毒有80多種（Brown et al.，2015），我國至少有16種（熊艷等，2011;Yang et al.，2011;Ding et al.，2016），其中番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）分布最廣。TYLCV最早在以色列番茄中被發現，目前已擴散到中東、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亞洲等多個國家和地區（Moriones and Navas-Castillo，2000），是引起全球番茄黃化曲葉病的主要病原病毒之一。2006年，該病毒傳入我國上海（Wu et al.，2006），之后在浙江、江蘇、山東等20個省（區）發生（姜靜等，2018;湯亞飛等，2019），造成嚴重的經濟損失，已成為引起我國長江流域及其以北番茄產區黃化曲葉病的優勢病毒種類。自從番茄黃化曲葉病在海南省發生以來，有研究者對引起海南番茄黃化曲葉病的病毒進行鑒定。Zhang等（2010）從2008年采集于海南海口的番茄病樣中鑒定出海南番茄曲葉病毒（Tomato leaf curl Hainan virus，ToLCHnV）;林韶東（2013）從海南三亞崖城鎮和樂東黃流鎮番茄上檢測到ToLCHnV和中國勝紅薊黃脈病毒（Ageratum yellow vein China virus，AYVCNV）;班一云（2017）從海南番茄病樣上檢測到中國番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）。目前尚未見在海南番茄上檢測到TYLCV的相關報道。【本研究切入點】2019年2月，本研究團隊在海南省三亞市、東方市和陵水縣番茄產區調查發現，田間番茄病株表現出嚴重的黃化、曲葉癥狀，調查田塊的發病率達100%。種植者反映近幾年番茄黃化曲葉病在海南省發生非常嚴重，給種植戶帶來慘重的經濟損失，但具體是何種病毒種類引起該病害大暴發尚不明確。【擬解決的關鍵問題】采用菜豆金色花葉病毒屬病毒的通用簡并引物AV494/CoPR（Wyatt and Brown，1996;何自福等，2004）對海南省三亞市、東方市和陵水縣番茄產區的疑似番茄黃化曲葉病樣本進行PCR檢測，并對PCR檢測為陽性的病樣進行滾環擴增（Rolling circle amplification，RCA），再進一步通過分子克隆和序列分析，明確引起海南番茄黃化曲葉病的病毒分子特征，為防控該病害提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 樣品采集 于2019年2月從海南三亞、陵水和東方番茄產區采集田間表現典型黃化曲葉癥狀（圖1）的番茄病樣葉片15份，樣本按采樣地點做好標記，帶回實驗室用于檢測;以人工注射接種TYLCV侵染性克隆引起發病的番茄植株葉片為陽性對照（CK+），室內未接種的健康番茄植株葉片為陰性對照（CK-）。

1. 1. 2 主要試劑和儀器設備 Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）和DNA片段純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;DNA滾環擴增試劑盒（IllustraTM TempliPhiTM kit）購自GE Healthcare公司;pGEM-T EASY和pGEM-3Z/5Z載體購自美國Promega公司;T4-DNA連接酶和BamH I等快速限制性內切酶等購自美國NEB公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒（GeneJET Gel Extraction Kit）購自美國Thermo賽默飛公司;植物基因組DNA提取試劑盒（EasyPure Plant Genomic DNA Kit）購自北京全式金生物技術有限公司;大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司;氨芐青霉素、X-gal、蔗糖、瓊脂糖和胰蛋白胨均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;綠如藍核酸染料DNAGREEN購自北京天恩澤基因科技有限公司;其他常規分析純試劑購自廣州市芊薈化玻儀器有限公司。T100TM Thermal cycler PCR儀和Universal HoodⅡ凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司;電泳儀購自美國E-C Apparatus Corporation公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 植物樣品總DNA提取 分別取番茄病株、陰性對照和陽性對照葉片各100 mg，按照植物DNA提取試劑盒說明書上的步驟進行總DNA抽提，DNA沉淀溶解于50 μL ddH2O中，于-20 ℃冰箱保存備用。

1. 2. 2 PCR檢測 利用檢測菜豆金色花葉病毒屬病毒的通用引物AV494/CoPR（Wyatt and Brown，1996;何自福等，2004）對采集的15份疑似番茄病樣進行PCR檢測。反應體系30.0 μL：植物總DNA 1.0 μL（約20 ng），Ex TaqTM Premix 15.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，滅菌水12.0 μL。反應程序：94 ℃預變性4 min;94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃45 s，進行35個循環;72 ℃延伸 10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 2. 3 基因組全序列擴增 挑選PCR檢測為陽性的代表病樣，按照illustraTM TempliPhiTM Kit說明書進行RCA擴增：將待測樣品總DNA 1.0 μL（約20 ng）與5.0 μL樣品緩沖液混勻，95 ℃變性3 min;置于冰上冷卻;加入5.0 μL反應緩沖液和0.2 μL DNA聚合酶，30 ℃恒溫下反應18～20 h;反應結束后在65 ℃下加熱10 min使酶失活，終止反應。RCA擴增產物分別用BamH I進行酶切。反應體系10.0 μL：RCA產物2.0 μL，BamH I內切酶1.0 μL，10×內切酶快速反應緩沖液1.0 μL，滅菌水6.0 μL。在37 ℃恒溫條件下酶切0.5～2.0 h，最后進行電泳分析。

1. 2. 4 基因克隆與序列分析 將RCA產物酶切出大小約2.7或1.3 kb的目的條帶進行回收純化，并連接到用相同內切酶處理后的線性化pGEM-3Z載體上，轉化至大腸桿DH5α感受態細胞，從每個平板隨機挑取3個陽性單菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。對測序獲得的基因序列利用DNAStar的SeqMan進行拼接，然后在GenBank數據庫中BLASTn程序進行相似性比對，利用SDT 1.2的MUSCLE alignment對序列相似性作進一步比較分析（Muhire et al.，2014），采用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）（Tamurak et al.，2013）構建系統發育進化樹，Bootstrapping值設置為1000。

2 結果與分析

2. 1 PCR檢測結果

利用檢測菜豆金色花葉病毒屬病毒的通用引物AV494/CoPR對采集的15份疑似番茄黃化曲葉病病樣進行PCR檢測，結果從15份疑似病樣的總DNA中均擴增到1條與目的片斷大小（570 bp）一致的特異性條帶，陰性對照中未擴增出任何片段（圖2）。表明海南番茄病樣中存在菜豆金色花葉病毒屬病毒。

2. 2 病毒基因組結構特征及序列分析結果

2. 2. 1 病毒基因組結構特征 從海南三亞、陵水和東方各選取1個PCR檢測為陽性的病樣進行RCA擴增，進一步對其產物進行酶切，3個RCA產物均能被BamH I內切酶切出1條大小約2.7 kb的單一條帶，將該條帶回收、克隆及測序，結果表明，來自海南三亞（SY）、陵水（LS）和東方（DF）的3個分離物全基因組大小均為2781 nt （GenBank登錄號分別為MK908813、MK908814和MK908815），且基因組結構特征完全一致，均為單鏈閉合環狀，含6個開放閱讀框（ORF），包括位于病毒鏈上編碼外殼蛋白的AV1基因（308～1084 nt）和編碼與病毒移動相關蛋白的AV2基因（148～498 nt），以及位于互補鏈編碼復制酶蛋白的AC1基因（1542～2615 nt）、編碼轉錄激活蛋白的AC2基因（1226～1633 nt）、編碼復制增強蛋白的AC3基因（1081～1485 nt）和編碼復制或轉錄調控因子的AC4基因（2171～2464 nt）。在AV2基因與AC1基因之間存在1個大小為313 nt的基因間隔區，該區域含有與該類病毒復制起始有關的保守序列TAATATTAC（位于2775～2782 nt）（Hanley-Bowdoin et al.，1999）。

2. 2. 2 相似性分析 經序列比對，發現侵染海南番茄的SY、LS和DF 3個分離物兩兩間序列相似性為98.9%、99.0%和99.2%，BLAST結果顯示，與侵染海南番茄的病毒全基因組序列有較高相似性的序列均為TYLCV分離物。進一步采用SDT 1.2的MUSCLE alignment進行相似性比較分析發現（表1），海南分離物與墨西哥、美國、韓國、哥斯達黎加、澳大利亞、埃及6國以及我國14個不同省（市）的20個TYLCV分離物相似性在98.0%以上，其中與墨西哥和美國分離物的相似性在99.0%以上;與荷蘭、古巴、約旦、格林納達和波多黎各5國分離物的相似性在97.3%～98.3%;與科威特、伊朗、日本、法國、西班牙和伊朗6國分離物的相似性為91.7%～95.1%;與阿曼分離物的相似性最低，均低于91.0%，分別為90.3%、90.7%和90.2%。

2. 2. 3 親緣關系分析 為明確TYLCV海南分離物與已報道的其他分離物之間的親緣關系，將TYLCV海南分離物與上述33個分離物進行系統進化分析，以海南番茄曲葉病毒（FN434083）為外組。結果（圖3）顯示，海南SY、LS和DF 3個分離物與墨西哥、美國及我國北京和江蘇分離物的親緣關系最近，聚集在一個小分支，進一步與來自我國其他12個省（市）、韓國、哥斯達黎加和澳大利亞的分離物形成一個分支，而與伊朗和阿曼分離物的親緣關系最遠。

3 討論

本研究首次從海南三亞、陵水和東方番茄黃化曲葉病病樣中檢測到TYLCV，并明確其大小為2781 nt，基因序列與來自墨西哥、美國及我國等17個國家32個TYLCV分離物的相似性均在91.0%以上，其中與我國其他不同省（市）的14個TYLCV分離物的相似性在98.0%以上，由此可知，入侵我國的TYLCV在基因序列上種群遺傳穩定，目前尚未發現較大變異。

系統發育進化樹顯示TYLCV海南分離物與墨西哥、美國及我國北京和江蘇分離物聚集在一個小分支，進一步與我國其他地區，韓國、哥斯達黎加、澳大利亞的分離物形成一個大分支。該結果表示TYLCV海南分離物與韓國、哥斯達黎加、澳大利亞、墨西哥、美國及我國其他地區分離物的親緣關系近，其中與墨西哥、美國及我國北京和江蘇分離物的親緣關系最近，但與伊朗及阿曼分離物的親緣關系較遠。進一步推測出侵染海南番茄的TYLCV分離物可能是通過從北京和江蘇等地調運的番茄種苗及煙粉虱帶毒進入海南，也有可能通過從墨西哥和美國等其他國家進口的番茄、苗木及煙粉虱帶毒等途徑傳入。

自從番茄黃化曲葉病在我國發生以來，各地的學者對該病害開展了相關研究，明確引起我國番茄黃化曲葉病的病毒種類復雜，且各省番茄黃化曲葉病的病毒種類存在很大差異。目前報道的病毒至少有16種（熊艷等，2011;Yang et al.，2011;Ding et al.，2016），其中TYLCV分布最廣，是引起華東、華北和西北等廣大番茄產區番茄黃化曲葉病的病原病毒。華南地區（廣東、廣西和海南）常年溫暖多濕，煙粉虱全年可以繁殖，導致番茄黃化曲葉病發生非常嚴重，病毒種類也很復雜，目前報道的危害廣東番茄的煙粉虱傳病毒有4種，分別為廣東番茄曲葉病毒（Tomato leaf curl Guangdong virus，ToLCGdV）（何自福等，2005b）、廣東番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl Guangdong virus，TYLCGdV）（何自福等，2005a）、臺灣番茄曲葉病毒（Tomato leaf curl Taiwan virus，ToLCTWV）（何自福等，2007）和TYLCV（湯亞飛等，2019）;危害廣西番茄的煙粉虱傳病毒有5種，分別為廣西番茄曲葉病毒（Tomato leaf curl Guangxi virus，ToLCGxV）、中國番茄曲葉病毒（Tomato leaf curl China virus，ToLCCNV）、AYVCNV、中國番木瓜曲葉病毒（Papaya leaf curl China virus，PaLCuCNV）和TYLCCNV（劉玉樂等，1998;Xu et al.，2007;Li et al.，2017）;危害海南番茄的煙粉虱傳病毒有3種，分別為ToLCHnV、AYVCNV和TYLCCNV（Zhang et al.，2010;林韶東，2013;班一云，2017）。由此可見，TYLCV雖然是引起華東、華北和西北等廣大番茄產區番茄黃化曲葉病的病原病毒，但在華南地區僅廣東省有分布，廣西和海南尚未發現TYLCV危害番茄的報道。本研究首次在海南番茄上檢測到TYLCV，可見該病毒在我國的危害范圍還在進一步擴大，已嚴重制約我國番茄產業的發展。

TYLCV主要靠煙粉虱帶毒和帶毒種苗調運等途徑進行傳播擴散，因此對未發生的區域應嚴格把好種苗關，確保種植無毒種苗，從源頭控制該病毒的危害。此外，生產上盡可能選擇抗病品種，嚴控煙粉虱發生，加強田間管理，可有效控制番茄黃化曲葉病的發生與流行。

4 結論

侵染海南番茄的TYLCV可能來自我國大陸的番茄等種苗和煙粉虱帶毒傳入，也有可能來自墨西哥和美國等其他國家。本研究首次在海南番茄上檢測到TYLCV，并明確其分子特征，為開展TYLCV在我國的擴散、種群遺傳特征分析、病毒變異與進化等研究提供了素材，更為海南省番茄黃化曲葉病的防控提供科學依據。

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（責任編輯 麻小燕）

收稿日期：2019-12-16

基金項目：國家重點研發計劃項目（2018YFD0201209）;廣東省基礎與應用基礎研究基金項目（2019A1515012150）;廣州市科技計劃項目（201904010173）;廣東省現代農業產業共性關鍵技術研發創新團隊建設項目（2019KJ134）

作者簡介：*為通訊作者，何自福（1966-），研究員，主要從事植物病理研究工作，E-mail：hezf@gdppri.com。湯亞飛（1980-），主要從事蔬菜病毒研究工作，E-mail：yf.tang1314@163.com