青黛作用于急性幼粒細胞白血病的可視化“藥靶蛋白模型”分析

王雪 孫長崗

摘要 目的：目前青黛已是治療急性幼粒細胞白血病（APL）的臨床有效藥物，但其分子機制與物質基礎仍不明確。基于此本研究構建青黛與APL可視化藥靶蛋白模型，以探究青黛作用于APL的分子機制。方法：通過GEO數據庫檢索APL微陣列芯片分析APL差異表達基因，使用TCMSP數據庫篩選青黛活性成分，結合PubChem和SwissTargetPrediction匹配活性成分的靶基因并進行富集分析。String用于挖掘并構建APL可視化蛋白互作數據，將其讀入Cytoscape，通過Centiscape實現網絡拓撲分析。綜合APL差異表達基因，通過Sybyl與青黛活性成分構建藥靶蛋白模型。結果：篩選出3張APL微陣列芯片，164個差異表達基因，9種青黛活性成分，541個靶基因，這些靶點較多地參與細胞凋亡、藥物結合、癌癥途徑、慢性粒細胞白血病等，這些都在APL中起重要作用。拓撲分析顯示ELANE，CTSS為核心基因，將其與青黛9種活性成分進行藥靶蛋白模型預測，顯示靛玉紅和靛藍與核心基因結合度最佳。結論：APL是受多基因調控的復雜疾病，而青黛成分中靛玉紅和靛藍可通過結合ELANE，CTSS作用于APL的發生發展。

關鍵詞 急性幼粒細胞白血病;青黛;藥靶蛋白模型;靛玉紅;靛藍;基因;網絡藥理;生物信息

Abstract Objective：Atpresent，NaturalIndigohasbeenusedasaclinicaldrugforthetreatmentofacutepromyelocyticleuke-mia（APL），butitseffectivemolecularmechanismandmaterialbasisarestillunclear.ThepurposeofthisstudyistoconstructthevisiblemodelofNaturalIndigoandAPLdrugtargetprotein，andtoexplorethemolecularmechanismofNaturalIndigoactingonAPL.Methods：TheAPLmicroarraychipwassearchedthroughtheGEOdatabasetoanalyzethediseasedifferentiallyexpressedgenes.TheTCMSPdatabasewasusedtoscreentheactiveingredientsofNaturalIndigo.PubChemandSwissTargetPredictionwereCombinedtomatchtargetgenesofactiveingredientsandenrichmentanalysisoftargetgeneswasdone.StringwasusedforfurthertextminingandconstructingaAPLvisualproteininteractionnetwork，theinteractiondatawasreadintoCytoscape，thenetworkto-pologyanalysiswasdonethroughthepluginCentiscape.AftercomprehensiveanalysisofAPLdifferentiallyexpressedgenes，SybylwasconstructedofdrugtargetproteinmodelwithNaturalIndigoactiveingredients.Results：ThreeAPLdisease-relatedmicroarraychips，164differentiallyexpressedgenes，9NaturalIndigoactivecomponents，541componenttargetgeneswerescreened.Thesetargetsaremoreinvolvedinapoptosis，drugcombination，cancerpathway，chronicmyelogenousleukemia，etc.，allofwhichplayanimportantroleinAPL.TopologicalanalysisshowedthatELANEandCTSSwerecoregenes，thedrugtargetproteinmodelpre-dictionwiththe9activeingredientsofNaturalIndigoshowsthatindirubinandindigohavethebestbindingtocoregenes.Conclu-sion：APLisacomplexdiseaseregulatedbymultiplegenes.TheindirubinandindigoinNaturalIndigocanactonthedevelopmentofAPLbycombiningELANEandCTSS.

Keywords Acutepromyelocyticleukemia;NaturalIndigo;Drugtargetproteinmodel;Indirubin;Indigo;Gene;Networkpharmacol-ogy;Biologicalinformation

中圖分類號：R285.6 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.004

急性早幼粒細胞白血病（AcutePromyelocytic Leukemia，APL）是急性髓系白血病的M3亞型，根據

其發熱、出血、貧血、感染和浸潤等臨床表現，可歸類于中醫“虛勞”“血證”“溫病”等范疇。古代文獻中雖無白血病之名，但有較多疾病癥狀的相似記載。《圣濟總錄》：“熱勞之證，心神躁、面赤、頭痛、眼澀、唇焦、身體壯熱，煩渴不止，口舌生瘡，食欲無味，肢體疼痛，多臥少起或時汗，日漸贏疫者是也”[1]。《素問·腹中論》記載：“病至則先聞腥臊臭，出清液，先唾血，四肢清，目眩，時時前后血……病名血枯”[2]。《普濟方》曰：“夫熱勞者，由心肺實熱，傷于氣血，氣血不和，臟腑壅滯，積熱在內，不能宣通所致也”[3]。上述癥狀均與APL的臨床表現相似。應用全反式維甲酸、三氧化二砷聯合化療是APL的標準治療方案[4]，這很大程度上提高了疾病緩解率，但是維甲酸綜合征、高白細胞危象、高顱壓綜合征等不良反應和高復發率促使臨床不斷探究新的治療方法，而中藥效緩、穩定、不易產生耐藥性更可以緩解化療的不良反應，使中藥成為APL的綜合治療中不可或缺的一部分。周靄祥教授臨床應用青黛治療白血病多年[5]，療效確切，但其作用機制尚不明確，值得進一步探究。

1 研究對象

青黛，別名靛花、靛沫、藍靛，為雙子葉爵床科植物馬藍、蓼科植物蓼藍、豆科植物木藍或十字花科植物菘藍的莖葉經加工制得的干燥粉末或團塊，味咸苦，性寒，歸肝經，具有清熱解毒、涼血止血、入營化斑、清肝瀉火等功效，主治溫病熱盛、小兒驚癇、斑疹、吐血、咯血、瘡腫、丹毒、蛇蟲咬傷等。青黛在古代醫書中的藥用記載始于《藥性論》[6]，君，味甘，平。能解小兒疳熱，消瘦，殺蟲。另《本草求真》[7]云，青黛專入肝，系藍靛浮沫，攪澄，掠出取干而成。

味咸性寒，色青，大瀉肝膽實火及肝經郁熱。《本草衍義補遺》[8]所言青黛能收五臟之郁火，解熱度，瀉肝，消食積。可見先人對于青黛的藥效有所肯定，而自二十世紀九十年代有大量的成功病例顯示將青黛及其方劑用于治療急性早幼粒細胞白血病有良好的治療效果[9-11]。有研究證實[12]青黛的有效成分靛玉紅具有抗腫瘤活性，用同位素標記前體分別滲入腫瘤組織的DNA、RNA及蛋白質的研究顯示，靛玉紅可以抑制急性幼粒細胞白血病患者的白血病細胞的DNA合成代謝，輕微抑制RNA合成，證實青黛有抗腫瘤的作用，但沒有系統的青黛與APL的研究。為詳細的闡明青黛活性成分與APL的相互作用，本文通過構建青黛與APL藥靶蛋白模型可視化青黛作用于APL的內在機制，為青黛治療APL提供理論基礎。

近年來，隨著系統生物學的不斷創新和發展，可視化模型模擬技術為探索中藥有效成分干預的內在原理，構建中醫藥多靶點精確治療模式提供了可行的研究策略。本研究通過以下方面探究青黛與APL的作用機制：1）檢索APL疾病表達數據，并分析差異表達基因;2）篩選青黛的活性成分，預測活性成分靶基因;3）分析APL差異表達基因與青黛活性成分可能的作用靶基因的關系，篩選出核心基因;4）核心基因與青黛活性成分構建可視化藥靶蛋白模型。通過以上分析來探究青黛與APL的內在關系，為中藥作用于疾病系統的提供理論見解。

2 研究方法

2.1 APL差異表達基因 基因表達數據庫（GEO，GENEEXPRESSION OMNIBUS，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）隸屬于美國國立衛生研究院，是現在最大最全面的公共基因表達數據資源[13]。從GEO中檢索apl的微陣列芯片，設定篩選條件為“Homosapiens”，共檢索到917張APL相關芯片。

進一步分析每張芯片的樣本數據后確定3張芯片作為APL 的疾病數據，即GSE34823，GSE12662，GSE995。將每張芯片的APL疾病樣本和正常對照樣本進行分組，通過GEO2R進行差異表達基因分析，得到差異表達基因后進行篩選，條件設置為adj.P.Val<0.05且|logFC|>1。

2.2 青黛所含活性成分的收集與處理 中藥系統藥理學數據庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-sp.php）由中華人民共和國藥典記載的499種中藥組成，含有29384種成分，3311種靶點，837種相關疾病[14]。提供了人體口服生物利用度、半衰期、藥物相似性、Caco-2通透性和血腦屏障等12項重要的ADME相關特性來進行藥物篩選和評價。通過TC-MSP獲取青黛的活性成分，根據成分的藥物動力學參數進行篩選，將口服生物利用度（OB）≥30%且成藥相似性（DL）≥0.18作為篩選條件。結合有機小分子生物活性庫（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和SwissTargetPrediction數據庫（ht-tp：//www.swisstargetprediction.ch/）預測每個活性成分對應的靶基因。

2.3 基因分析 DAVID （DAVID：https：//DAVID.ncifcrf.gov/）是一個全面的功能注釋工具，能夠分析大量基因背后的生物學意義[15]。將青黛靶基因上傳至DAVID進行基因本體論（GeneOntol-ogy，GO）和京都基因與基因組百科全書（KyotoEn-cyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）分析，顯示路徑的截止閾值設為P<0.05。

2.4 網絡構建 String數據庫（https：//String-db.org/cgi/input.pl）是一個預測已知蛋白相互作用關系的在線數據庫，共有5090個物種和24584628種蛋白[16]。Cytoscape是一個專注于蛋白質網絡可視化和分析的軟件，其核心是提供基礎的功能布局和查詢網絡[17]。利用String數據庫和Cytoscape

3.5.1軟件構建APL差異表達基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡。使用Centiscape2.2對PPI網絡進行拓撲分析。Centiscape2.2插件基于直徑，度數，壓力，中介性，放射性，緊密度，質心值，離心值執行拓撲分析，篩選出最顯著的差異表達基因為核心

基因。

2.5 可視化藥靶蛋白分析 應用SybylX8.1中的SurflexDock程序構建青黛活性成分與APL顯著差異基因的可視化藥靶蛋白模型。在PubChem數據庫獲取青黛活性成分的小分子文件作為配體，從PDB數據庫中下載拓撲分析得出的ALP顯著差異基因三維晶體結構作為受體，除去晶體分子所有的水分子和小分子配體，并加極性氫，加載電荷，構建活性口袋。再輸入小分子文件，分別構建藥靶蛋白模型。用配體受體親和力的一致性評分函數進行打分，并對藥靶蛋白模型進行觀察、分析。

3 結果分析

3.1 基因比較分析 通過數據庫篩選出青黛的9個活性成分。見表1。成分的作用靶基因541個。

分析APL3張芯片后，發現GSE34823含有626個差異表達基因，GSE12662含有13481個差異表達基因，GSE995含有2128個差異基因。Veen（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny_old/index.html）在線分析后，得到164個三芯片共同差異基因，即APL差異表達基因。見圖1。將541個青黛作用靶點基因和164個APL差異表達基因比較分析，發現共同重疊基因10個，分別是ELANE，CFD，CTSS，QPCT，MCL1，TYMP，PRKCH，CCNA1，DYRK2，CTSL。

3.2 青黛靶基因富集功能 通過DAVID6.8工具

對青黛作用靶基因進行GO和KEGG通路的功能富集，從而揭示青黛治療APL的潛在作用機制。結果得出青黛靶基因主要富集到的功能涉及凋亡過程的負調控、細胞內信號轉導、細胞增殖、細胞核等GO功能和癌癥、PI3K-Akt、cAMP、病毒致癌、神經活性配體-受體相互作用等KEGG通路，與APL密切相關。見圖2。

3.3 APL網絡構建分析 通過Cytoscape軟件構建出APL蛋白-蛋白相互作用網絡，由145個節點和824條邊組成。見圖3。根據拓撲學指標Degreeun-Dir，DegreeunDir值最大的節點處于PPI網絡調控的中心，故選擇DegreeunDir≥17.5%來篩選此網絡核心節點，即ITGAM，CXCL8，ELANE，ITGB2，CD86，CTSS等。見圖4。我們綜合分析結果，篩選出此網絡的核心節點ELANE，CTSS既是青黛靶基因和APL差異表達基因的共同重疊基因又是PPI網絡的核心節點，故選擇這2個基因最下一步藥靶蛋白構建。

3.4 青黛活性成分與APL可視化藥靶蛋白構建 通過將2個核心基因ELANE、CTSS與青黛9種活性成分構建藥靶蛋白模擬發現，青黛的活性成分靛玉紅、靛藍與ELANE，CTSS結合度較高，提示靛玉紅、靛藍干預ELANE，CTSS可能在青黛治療APL中起重要作用。見圖5。

4 討論

APL是屬于急性非淋巴細胞白血病的惡性腫瘤，占成人急性非淋巴細胞白血病10%～15%，發病中位年齡約40歲，男女發病率基本相等[18]。西醫學認為APL主要的發病機制為特征性染色體15號和17號染色體分別斷裂并易位t（15;17），在分子水平形成PML-RARα融合基因，其翻譯產物PML-RARa融合蛋白阻滯白細胞正常分化及凋亡，導致骨髓中大量的異常早幼粒細胞堆積，導致APL的發生[19]。中醫學認為APL的病因病機主要為正氣虧虛，損傷骨髓，復感外邪，犯營入血。骨髓是APL的病變部位，溫熱邪毒由表入里或發為伏火，損傷骨髓，邪毒犯營入血，耗傷陰經氣血，導致脾腎虧損，進而累及其他臟腑，最終形成骨髓惡性增殖病變。故APL的治療著重祛熱解毒扶正。眾多醫家[10，20-21]在治療APL上的不斷探索發現全反式維甲酸、三氧化二砷聯合化療結合青黛方劑治療能夠降低早期死亡率、獲得更高療效、減少化療不良反應等優勢。青黛味咸，性寒，歸肝、肺、胃經，《本草經疏》謂其“解毒除熱，固其所長”，可清熱、涼血、解毒，在中醫理論體系指導下治療APL可謂方證相對，促使我們對青黛作用于APL的內在機制進行探究。

我們運用藥物與疾病的藥靶蛋白構建技術，來闡述青黛治療APL的有效物質基礎和治療靶點。

將復雜多樣的中藥成分，以及其活性成分在人體內不確定性的相互作用，轉化為蛋白質為主體的系統研究。蛋白質是生命活動的主要承擔者，其功能的實現，如基因表達調控，細胞信號轉導，細胞增殖、凋亡、分化等均取決于蛋白質之間的相互作用[22]。因此，PPI網絡的研究和分析能夠可視化藥物和疾病的組分、進程和功能。使用算法對研究的PPI網絡進行拓撲分析，可以找到主導疾病生物行為的關鍵靶點，再與藥物有效成分進行藥靶蛋白分析，篩選出作用于疾病的最有效藥物成分，為臨床應用藥物干預疾病提供理論基礎。基于此，我們通過TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction數據庫篩選青黛有效成分，GEO數據庫獲取APL疾病芯片后，構建了由145個節點（蛋白質）和824條邊（相互作用）構成的APL的PPI，繼續進行拓撲分析得出2個核心基因ELANE，CTSS，進一步與篩選出青黛的9種活性成分進行藥靶蛋白構建，得出作用于APL最相關的青黛活性成分，即靛玉紅、靛藍。

靛玉紅是是中國經典名方當歸龍薈丸的主要活性成分，用于治療慢性粒細胞性白血病[23]。吳琦瑋[24]通過體外試驗發現，靛玉紅對人早幼粒白血病HL60細胞株和人白血病K562細胞株均具有明顯的抑制作用。更有文獻表明靛玉紅能夠抑制人白血病幼粒細胞合成，靛玉紅與ELANE基因的對接打分為5.4478， 顯示有較好的結合強度， 而ELANE與中性粒細胞數量密切相關，其突變的患者有很高的風險發展成急性髓系白血病或骨髓異常增生[25]。ArunAK通過對52名遺傳性中性粒細胞減少癥患者進行研究，從患者外周血白細胞中提取基因組DNA，測序進行突變分析發現ELANE出現不同的基因錯義、移碼或剪接位點變異，延緩中性粒細胞分裂成熟，而導致反復的細菌感染，導致骨髓疾病的發生。故靛玉紅作用于ELANE進而干預骨髓內中性粒細胞的異常分化，對APL的治療起到關鍵作用。

靛藍是青黛的有效成分之一，具有抗炎鎮痛作用。劉麗娟[26]研究靛藍對構建體外RAW264.7炎性反應細胞模型進行實驗發現，靛藍通過下調IL-6的表達來減輕RAW264.7炎性反應細胞模型的炎性反應，得出靛藍具有抗炎的作用。我們通過藥靶蛋白分析顯示，靛藍與CTSS基因的對接打分是6.0087，顯示有較強的結合度，而CTSS與炎性反應密切相關。CTSS是一種與自身免疫性疾病密切相關的半胱氨酸蛋白酶，在人體的生理和病理過程中發揮著至關重要的調節功能。目前已有研究證實CTSS的生物學功能與炎性反應通路相關。更有研究表明，CTSS通過促進細胞外基質降解，參與VEGF等生長因子分泌而促進腫瘤血管形成，從而促使血管內外腫瘤細胞的侵襲和轉移[27]。而我們進行KEGG通路分析的結果也顯示青黛活性成分的靶基因通過眾多癌癥途徑包括VEGF信號通路參與APL的反應過程，為靛藍起效于APL有力支持。

我們通過藥理分析，得出青黛活性成分的靶基因在生物過程主要富集于細胞凋亡、細胞增殖、細胞遷移、細胞內信號傳導、炎性反應等;在分子功能方面主要集中于ATP、藥物結合、血紅素血清素結合等;在細胞組成方面主要體現在細胞質、細胞核、細胞連接等;在通路分析主要富集于癌癥途徑、急性髓系白血病、慢性粒細胞白血病、VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路等。這些生理過程都與APL的發生發展密切相關。又通過進一步分析得出靛玉紅和靛藍與APL差異表達核心基因ELANE，CTSS有較好的結合強度。

本研究在臨床應用青黛獲取肯定療效的前提下，將青黛作用于APL的內在分子機制通過藥物與疾病的藥靶蛋白模型分析，最終發現青黛的活性成分靛玉紅和靛藍可作用于ELANE，CTSS來干預APL的發生發展。從內在分子學和藥理學角度為青黛干預APL提供了臨床應用理論依據。此外我們構建可視化藥物-疾病藥靶蛋白模型，為探究中藥潛在作用機制提供了新模式，也為中藥作用于疾病的展現新見解。

參考文獻

[1]趙佶，鄭金生，汪惟剛，等.圣濟總錄[M].北京：人民衛生出版社，2013：158.

[2]佚名.黃帝內經素問[M].北京：中國醫藥科技出版社，1996：307.

[3]朱？，金瀛鰲.普濟方集要[M].沈陽：遼寧科學技術出版社，2007：231.

[4]陶曉明，馮翠，李虎生，等.三氧化二砷、全反式維甲酸聯合化療治療初發急性早幼粒細胞白血病的臨床觀察[J].腫瘤基礎與臨床，2013，26（1）：18-21.

[5]胡曉梅，劉鋒，麻柔，等.周靄祥運用青黃散治療白血病的經驗[J].中醫雜志，2011，52（14）：1187-1189.

[6]尚志鈞.藥性論-輯釋本藥性趨向分類論.安徽：安徽科學技術出版社[M].2000：522-523.

[7]黃宮繡.本草求真[M].北京：中國中醫藥出版社，1997：298.

[8]黃宮繡，劉理想，潘秋平.本草求真演繹[M].北京：學苑出版社，2011：198.

[9]向陽，黃世林，郭愛霞，等.復方青黛片為主治療急性早幼粒細胞白血病60例[J].解放軍醫學雜志，1995，11（3）：227-229.

[10].秦似龍，楊科.復方青黛片治療急性早幼粒細胞白血病療效[J].臨床血液學雜志，1999，12（1）：23.

[11]黃世林，郭愛霞，向陽，等.復方青黛片為主治療急性早幼粒細胞白血病的臨床研究[J].中華血液學雜志，1995，16（1）：26-28，53-54.

[12]曾慶田，杜德極，謝定成，等.靛玉紅衍生物的抗腫瘤活性[J].中草藥，1982，13（1）：24-30.

[13]TanyaBarrett，StephenE.Wilhite，etal.NCBIGEO：archiveforfunctionalgenomicsdatasets—update[J].NucleicAcidsResearch，2013，D1（41）D991-D995.

[14]汝錦龍.中藥系統藥理學數據庫和分析平臺的構建和應用[D].咸陽：西北農林科技大學，2015.

[15]JiaoX，ShermanBT，HuangDW，etal.DAVID-WS：astatefulwebservicetofacilitategene/proteinlistanalysis[J].Bioinformatics，2012，28（13）：1805-1806.

[16]SzklarczykDamian，GableAnnikaL，LyonDavidetal.STRINGv11：protein-proteinassociationnetworkswithincreasedcoverage，supportingfunctionaldiscoveryingenome-wideexperimentaldatasets[J].Nucleicacidsresearch，2019，47（D1）：1101-1103.

[17]MichaelE.Smoot，KeiichiroOno，JohannesRuscheinskietal.Cyto-scape2.8：newfeaturesfordataintegrationandnetworkvisualization[J].Bioinformatics，2011，3（27）：431-432.

[18]秘營昌，王建祥.我國急性白血病的診斷治療現狀[J].國際輸血及血液學雜志，2006，29（4）：290-291.

[19]鐘少東，蔡曉燕.急性早幼粒細胞白血病發病機制及治療進展[J].安徽醫藥，2011，15（3）：277-280.

[20]楊俊超，李麗，王建英，等.小劑量HA方案聯合ATRA、復方青黛片治療急性早幼粒細胞白血病30例臨床觀察[J].現代中西醫結合雜志，2004，18（19）：2543-2544.

[21]孫鋒，陳楠楠，成玉斌.復方黃黛片治療急性早幼粒細胞白血病204例經驗總結[J].中西醫結合學報，2008，6（6）：639-642.

[22]劉存，劉麗娟，周超，等.基于“蛋白質相互作用網絡-分子對接技術-體外實驗”三維模式分析青黛對慢性粒細胞白血病的作用機制[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（21）：206-211.

[23]籍秀娟，張福榮.靛玉紅類化合物的抗腫瘤作用及構效關系的研究[J].藥學學報，1985，20（2）：137-139.

[24]吳琦瑋，葛忠良，高月，等.靛玉紅對腫瘤細胞抑制作用的研究及相關機制探討[J].天津中醫藥，2008，25（1）：55-58.

[25]ArunA K，SenthamizhselviA，HemamaliniS，etal.Spectrum ofELANEmutationsincongenitalneutropenia：asingle-centrestudyinpatientsofIndianorigin[J].Journalofclinicalpathology，2018，71（12）：1046-1050.

[26]劉麗娟，王允亮，李軍祥.靛藍對潰瘍性結腸炎體外炎性反應模型的作用[J].中華中醫藥雜志，2014，29（5）：1666-1669.

[27]張智，郭鵬，肖藝，等.組織蛋白酶S與惡性腫瘤[J].中國癌癥防治雜志，2017，9（1）：75-79.

（2020-03-02收稿 責任編輯：王明）