大黃黃連瀉心湯對幽門螺旋桿菌感染的系統藥理學研究

魯春花 趙凱 薩震

摘要 目的：運用系統藥理學探討大黃黃連瀉心湯對治療幽門螺旋桿菌感染的分子作用機制，挖掘潛在的作用靶點和信號通路。方法：首先利用中醫藥整合數據庫（SymMap）篩選大黃黃連瀉心湯的潛在作用靶點;從比較毒理基因組學數據庫（CTD）發現幽門螺旋桿菌感染的相關疾病靶點;將篩選后的靶點輸入到String中構建“大黃黃連瀉心湯-幽門螺旋桿菌”的蛋白質相互作用網絡（PPI）;采用在線分析工具WebGestalt對篩選出的靶點進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。結果：獲得大黃黃連瀉心湯和幽門螺旋桿菌感染重合的靶點共有222個，通過PPI網絡發現71個相互作用靶點，其中主要以IL6、MYC、VEGFA、CASP3、EP300、IL10、ERBB2、CDKN1A、MPO、NFE2L2為關鍵靶點;發現10個關鍵生物過程和10條關鍵信號通路。結論：大黃黃連瀉心湯可能通過調節機體免疫炎性反應，發揮對幽門螺旋桿菌感染的治療作用，同時可能通過抗腫瘤機制起到防止幽門螺旋桿菌感染進一步向更嚴重胃腸道疾病轉化的作用。本研究為中醫藥治療幽門螺旋桿菌提供了理論依據。

關鍵詞 大黃黃連瀉心湯;幽門螺旋桿菌;系統藥理學;胃癌;網絡分析

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Dahuang Huanglian Xiexin Decoction in the treatment of helicobacter pylori infection by systematic pharmacology，and to explore potential targets and signal pathways.Methods：First，the integrated Chinese medicine database （SymMap） was used to screen the potential targets of Dahuang Huanglian Xiexin Decoction; the relevant disease targets of helicobacter pylori infection was found from the comparative toxicology genomics database （CTD）; the protein interaction network （PPI） of “Dahuang Huanglian Xiexin Decoction-Helicobacter pylori” was constructed in String after the screened target entered into it; the online analysis tool WebGestalt was used to perform GO function annotation and KEGG pathway enrichment analysis on the selected targets.Results：There were 222 overlapping targets of Dahuang Huanglian Xiexin Decoction and Helicobacter pylori infection coinciding.A total of 71 interactive targets were located through the PPI network.Among them，IL6，MYC，VEGFA，CASP3，EP300，IL10，ERBB2，CDKN1A，MPO and NFE2L2 were key targets; 10 key biological processes and 10 key signaling pathways were discovered.Conclusion：Dahuang Huanglian Xiexin Decoction may play a therapeutic role in the treatment of helicobacter pylori infection by regulating the body′s immune inflammatory response and at the same time it may prevent the infection of helicobacter pylori from further transforming to more severe gastrointestinal diseases by anti-tumor mechanism.This study provides solid theoretical basis for TCM treatment of helicobacter pylori.

Keywords Dahuang Huanglian Xiexin Decoction; Helicobacter pylori; Systematic pharmacology; Gastric cancer; Network analysis

中圖分類號：R285.6文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.005

幽門螺旋桿菌（Helicobacter Pylori，Hp）是一種能夠吸附在胃的上皮細胞的革蘭氏陰性、微需氧性、對生長條件要求十分苛刻的細菌。1983年首次從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜活檢組織中將幽門螺旋桿菌分離成功，主要寄生在人的胃里，是目前所知能夠在人胃中生存的唯一微生物種類，目前，西醫殺滅幽門螺旋桿菌主要采用三聯療法，包括使用奧美拉唑、阿莫西林和克拉霉素持續10～14 d的療程。值得警惕的是，由于克拉霉素的耐藥性上升，導致幽門螺旋桿菌的根除率正在下降[1]。此外，臨床上還有在三聯的基礎上聯合使用鉍劑，但是鉍劑使用不當會引起急性腎衰竭[2-3]。中醫中藥治療幽門螺旋桿菌感染有獨特的優勢，中醫一般認為幽門螺旋桿菌感染屬于脾胃積熱，治療上通常可以采用清熱化濕，清熱解毒等治療思路。大黃黃連瀉心湯出自《傷寒論》，原方由大黃、黃連、黃芩3味藥組成。大黃能清熱瀉火、涼血解毒，黃連和黃芩均能清熱燥濕、瀉火解毒，但黃連清熱燥濕之力勝于黃芩，擅長清中焦脾胃濕熱。現代藥理學研究，大黃的化學成分主要是蒽醌衍生物，有抗感染作用，對多種革蘭氏陽性和陰性菌有抑制作用;黃連主要有效成分包括黃連堿、小檗堿，對金黃色葡萄球菌有抑制作用;黃芩有效成分主要是黃芩苷和黃芩素，對革蘭氏陰性菌有不同程度的抑制作用[4]。大黃黃連瀉心湯能與多種組方配伍，在中醫臨床上廣泛用來治療消化道炎性反應[5]，但治療機制還有待研究。近年來，系統藥理學的發展為中醫藥研究提供了新的研究方法[6]，從而為系統深入的揭示中醫藥對疾病和機體的相互作用機制提供了幫助，促進了中藥新藥的研發。本研究主要用系統藥理學的方法探討大黃黃連瀉心湯對幽門螺旋桿菌感染的治療作用，構建大黃黃連瀉心湯的關聯性網絡模型，篩選關鍵治療靶標，對其進行功能分析，明確其有效組份對幽門螺旋桿菌的作用機制，拓展其在臨床上使用大黃黃連瀉心湯為基礎的中醫組方治療治伴隨幽門螺旋桿菌感染的胃炎及胃潰瘍的可能性。

1 材料與方法

1.1 大黃黃連瀉心湯的作用靶點篩選 首先通過中醫藥整合數據庫SymMap[7]（An integrative database of traditional Chinese Medicine enhanced by symptom mapping，https：//www.symmap.org/）分別輸入大黃黃連瀉心湯中大黃、黃連、黃芩3味中草藥的名稱，選擇參數P<0.05，篩選出其潛在的作用靶點。該平臺將傳統中醫藥的癥狀描述和現代醫學分子作用機制整合在了一起，將疾病-癥狀-中草藥-成分-靶標關聯到一起，并通過直接或間接統計推斷形成關系網絡。

1.2 幽門螺旋桿菌感染相關疾病靶點預測 通過比較毒理基因組學數據庫CTD[8]（Comparative Toxicogenomics Database，http：//ctdbase.org/），輸入“Helicobacter Infections”，獲取幽門螺旋桿菌感染的疾病潛在靶點。

1.3 藥物-靶點網絡構建 將大黃黃連瀉心湯的藥物潛在作用靶點與幽門螺旋桿菌感染的相關疾病靶點數據進行重疊處理，將2組數據分別導入韋恩圖在線繪制工具Draw Venn Diagrams[9]（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），即可發現大黃黃連瀉心湯與幽門螺旋桿菌感染的交集靶點。

1.4 預測作用靶點的蛋白質相互作用網絡構建和關鍵靶標的篩選 將大黃黃連瀉心湯和幽門螺旋桿菌感染交集靶點輸入String[10]（Protein-Protein Interaction Networks，PPI，https：//string-db.org/），構建篩選出的靶點之間的蛋白質相互作用網絡并進行分析。在String中首先選擇“Multiple proteins”，然后輸入上述靶點信息，選擇“Homo sapiens”，選擇最低相互作用得分為0.4，作為篩選靶點相互作用關系的參數。將String中獲得的蛋白質互作網絡關系導入到Cytoscape 3.7.2[11]軟件中，從而使PPI互作關系可視化。使用Cytoscape中的Tool-Network Analysis-Generate Style from Statistics工具，按照網絡的拓撲學參數進行可視化調整。

1.5 相關靶點的GO功能分析和KEGG通路富集分析 通過在線基因分析工具包WebGestalt[12]（Web-based Gene Set Analysis Toolkit，http：//www.webgestalt.org/）對大黃黃連瀉心湯作用于幽門螺旋桿菌感染的相關靶點進行GO（Geneontology）功能富集分析和KEGG通路富集分析，發現大黃黃連瀉心湯的主要作用信號通路，并對富集結果進行可視化。

2 結果

2.1 大黃黃連瀉心湯治療幽門螺旋桿菌感染的靶點預測和篩選 從SymMap數據庫中查找到大黃的作用靶點有72個，黃連的作用靶點有140個，黃芩的作用靶點有106個，將三者做重合比較之后共篩選得到大黃黃連瀉心湯的成分作用靶點268個，作為候選靶點。從CTD數據庫中共發現潛在的幽門螺旋桿菌感染相關疾病靶點共8 048個。將大黃黃連瀉心湯的靶點和幽門螺旋桿菌感染的疾病靶點作韋恩圖重疊繪制后取交集，共得到222個藥物-疾病作用靶點。見圖1。

2.2 大黃黃連瀉心湯對幽門螺旋桿菌感染作用靶點的PPI網絡構建 根據String的PPI網絡計算結果最終得到71個相互作用節點（Nodes），367條邊（Edges），PPI網絡富集P值<1.0e-16，有統計學意義，見圖2。網絡中的拓撲學參數包括自由度（Degree）表示網絡中該節點與其他節點的連接數，用節點的大小表示，自由度越高，點越大;節點的接近中心性（Closeness）為該節點與其他節點的接近程度，用節點的顏色來表示，顏色越深表明關聯性越大;關聯性評分（Combined score）表示2個節點之間的關聯性強度，用邊的粗細來表示，邊越粗意味著關聯性越強。由String顯示該網絡節點的平均Degree為9.79，平均聚類系數為0.579。利用Cytoscape中的cytoHubba插件根據拓撲學參數Degree篩選出排序最高的前10個關鍵節點，包括：IL-6（白細胞介素-6），MYC（MYC原癌基因），VEGFA（血管內皮生長因子A），CASP3（caspase3），EP300（E1A結合蛋白p300），IL-10（白細胞介素-10），ERBB2（Erb-b2受體酪氨酸激酶2），CDKN1A（細胞周期素依賴性激酶抑制劑1A），MPO（髓過氧化物酶），NFE2L2（核因子 紅細胞樣2）。節點的顏色越深，表明得分越高。見圖3。

2.3 預測作用靶點的GO功能分析 將通過PPI構建獲得的71個相互作用靶點輸入到WebGestalt在線工具中，依次選擇“Homo sapiens”“Over-Representation Analysis”“geneontology”“Biological Process”，即可得到GO分析結果。見表1和圖5。涉及的GO過程主要包括：對含氧化合物的反應，對非生物刺激的反應，對藥物的反應，對脂質的反應，對氧氣水平的反應，對氧氣水平降低的反應，對缺氧的反應，對活性氧的反應，對有機環狀化合物的反應，對無機物的反應。綜上可以看出，大黃黃連瀉心湯對幽門螺旋桿菌的作用靶點主要集中在對各種氧化代謝的反應過程中。見圖4。

2.4 預測作用靶點的KEGG通路富集分析 再將71個相互作用靶點輸入到WebGestalt在線工具中，依次選擇“pathway”“KEGG”，即可獲得KEGG通路富集分析結果。見表2。其中主要包括細胞周期，癌癥途徑，p53信號通路，前列腺癌，HIF-1信號通路，FoxO信號通路，細胞衰老，膀胱癌，PI3K-Akt信號通路，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路。見圖6。

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（2020-01-23收稿 責任編輯：王明）