芪歸方有效組分治療特發性肺纖維化的實驗研究

彭艷芳 張瑩雯 張亞兵

摘要 目的：基于Smurf2串話TGF-β1/Smad信號通路研究芪歸方有效組分對轉化生長因子β1（TGF-β1）誘導人胚肺成纖維細胞MRC-5的影響及機制。方法：體外予以10 ng/mL TGF-β1培養MRC-5細胞，PCR儀檢測α-SMA的mRNA水平判斷模型是否成功。設立正常對照組、模型組（10 ng/mL TGF-β1處理）、潑尼松處理組、芪歸方有效組分高劑量組、中劑量組、低劑量組，采用CCK-8法檢測MRC-5的增殖情況，Western blot檢測各組細胞Smad7、SnoN蛋白的表達水平，RT-PCR檢測各組細胞Smurf2的mRNA水平。結果：與正常對照組比較，48 h模型組細胞增殖明顯，α-SMA的mRNA水平增加（P<0.01），造模成功。經10 ng/mL TGF-β1處理細胞MRC-5，與正常對照組比較，Smad7、SnoN蛋白水平顯著降低，Smurf2蛋白mRNA水平升高（P<0.01或P<0.05）。不同濃度芪歸方有效成分處理組細胞增殖降低，可逆轉以上各指標的改變，呈一定的量效關系。結論：芪歸方有效組分能抑制MRC-5細胞增殖，可通過減少MRC-5細胞中Smurf2所介導的Smad7、SnoN的泛素化，恢復Smad7、SnoN蛋白的表達，從而調節肺纖維化的發生發展。

關鍵詞 芪歸方有效組分;Smad泛素化調節因子2;Smad蛋白;核轉錄共抑制因子;特發性肺纖維化

Abstract Objective：Based on Smurf2 crosstalk TGF-β1/Smad signaling pathway to study the effect and mechanism of Qigui Fomula active components on transforming growth factor β1 （TGF-β1）-induced human embryo lung fibroblast MRC-5. Methods：MRC-5 was cultured with 10 ng/mL TGF-β1 in vitro， mRNA level of α-SMA was detected by PCR instrument to judge whether the model was successfully made. Normal control group， model group （10 ng/mL TGF-β1 treatment）， prednisone treatment group， high-dose group， middle-dose group and low-dose group of effective components of Qigui Fomula were set， CCK-8 method was used to detect the proliferation of MRC-5， Western blot was used to detect the expression level of Smad7 and SnoN protein in each group， and RT-PCR was used to detect the mRNA level of Smurf2 in each group. Results：Compared with the normal control group， the 48 h model group had significant cell proliferation， and the mRNA level of α-SMA increased （P<0.01）， and the modeling was successful. Compared with the normal control group， MRC-5 treated with 10 ng/mL TGF-β1 showed that Smad7 and SnoN protein levels were significantly reduced and Smurf2 protein mRNA levels were increased （P<0.01 or P<0.05）. The cell proliferation of the Qigui Foluma group with different concentrations was reduced， which could reverse the changes of the above indicators and showed a certain dose-effect relationship. Conclusion：The effective components of Qigui Foluma can inhibit the proliferation of MRC-5 cells， and can reduce the ubiquitination of Smad7 and SnoN mediated by Smurf2 in MRC-5 cells， restore the expression of Smad7 and SnoN proteins， and thereby regulate the occurrence of pulmonary fibrosis development.

Keywords Effective Component of Qigui Foluma; Smad ubiquitination regulator 2; Smad protein;Nuclear transcription co-suppressor; Idiopathic pulmonary fibrosis

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.009

特發性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）是一種病因不明，以肺泡間質炎性細胞浸潤、成纖維細胞異常增殖和膠原蛋白沉積為特征的免疫介導的慢性進行性纖維化性間質性肺炎，好發于中老年男性，主要表現為干咳、進行性加重的呼吸困難，伴限制性通氣功能障礙和氣體交換障礙，導致低氧血癥，患者最終因呼吸衰竭而死亡[1-2]。我國IPF發病率呈較快上升趨勢，盡管近年來我們對IPF發病機制的認識和治療有了一定的進展，但目前除了肺移植及長期氧療，尚無療效確切的治療手段，該病給社會、家庭、患者帶來了嚴重的壓力和經濟負擔。中醫藥[3]在防治IPF上的研究亦日趨增多，積累了寶貴的經驗，能起到緩解臨床癥狀和減輕患者服用激素等后出現的不良反應，顯示了良好的應用前景，日益受到國內外學者的重視。

文獻研究發現，氣虛血瘀是IPF常見的證候特征，益氣活血是該病的基本治法，采用中藥治療IPF的藥物多具有補氣益肺、化痰止咳、活血化瘀等功效，而黃芪、當歸及其藥效成分則是相關研究的熱點，我們前期以芪歸方治療IPF進行了臨床和實驗研究[4]，提示芪歸方聯合潑尼松治療特發性肺纖維化，可以明顯改善IPF患者癥狀，抑制TNF-α、轉化生長因子β1（Transforming Growth Factor β1，TGF-β1）等炎性反應因子表達;芪歸方可通過調控miRNA及其TGF-β1信號通路而改善特發性肺纖維化。但中藥復方成分復雜，不易進行質控，中藥有效單體成分的藥理作用更明確，故本研究在現代醫學技術和研究方法的指導下，進行體外實驗，以TGF-β1刺激人胚肺成纖維細胞MRC-5為研究對象，觀察芪歸方有效組分能否通過調節Smad泛素化調節因子2（Smad ubiquitin regulatory factor2，Smurf2）所介導的Smad7、核轉錄共抑制因子SnoN（Ski-related novel protein N）的泛素化，影響TGF-β1/Smad通路繼而發揮抗肺纖維化作用，為肺纖維化的治療提供新的方向。

1 材料

1.1 細胞與藥物 MRC-5人胚肺成纖維細胞使用1株，購自武大細胞庫。芪歸方有效組分（黃芪甲苷，含量>98%，分子式C41H68O14，分子量784.97;阿魏酸，含量>99%，分子式C10H10O4，分子量194.19）均購自上海哈靈生物科技有限公司，常溫避光防潮保存。

1.2 儀器 CO2恒溫培養箱（3111型，美國Thermo公司）;超凈工作臺（SW-CJ-1D型，蘇州凈化設備有限公司）;熒光定量PCR儀（CFX-Connect 96型，Bio-Rad公司）;高速冷凍離心機（Icen-24R型，杭州奧盛設備有限公司）;超微量分光光度計（Nano-300型，杭州奧盛設備有限公司）;酶標儀（AMR-100型，杭州奧盛設備有限公司）;倒置熒光顯微鏡（DMIL LED型，Leica公司）;全自動化學發光分析儀（Tanon-5200型，上海天能設備有限公司）;電泳儀（mini protean 3 cell型，BIO-RAD公司）。

1.3 試劑 MEM（Gibco公司，批號：c11095500bt）;胎牛血清（Gibco公司，批號：10270-106）;CCK8（Solarbio公司，批號：CA1210）;TGF-β1（Abcam公司，批號：ab92486）;α-SMA（Bioswamp，批號：PAB35136）;Smad7（Bioswamp，批號：PAB30992）;SnoN（Bioswamp，批號：PAB41857）;Smurf2（Bioswamp，批號：PAB37109）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio，批號：PC0020）。

2 方法

2.1 TGF-β1誘導人胚肺成纖維細胞MRC-5肺纖維化模型的構建

2.1.1 細胞培養 將MRC-5細胞培養在含10%胎牛血清的MEM/EBSS培養基中，加入105 U/L的青霉素和100 g/L的鏈霉素，并置于37 ℃，5%CO2的無菌培養箱中培養，5～7 d傳代，以1∶2的比例進行。

2.1.2 特發性肺纖維化模型的構建 將MRC-5細胞以1×105/L的密度分于6孔板，每孔加入2 mL培養基，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，使細胞貼壁。正常組換正常培養基，模型組細胞培養基中加入終濃度為10 ng/mL的TGF-β1，繼續培養24 h、48 h、72 h后收取細胞樣品。使用TRIzolTM Plus RNA Purification Kit進行RNA抽提，測定RNA濃度及純度，并用反轉錄試劑Rever Tra Ace Qrcr RT Master Mix按照1 μg/10 μL體系進行逆轉錄;之后以GAPDH為內參，于qRT-PCR儀檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）的mRNA表達水平，α-SMA引物：F：GGTGATGGTGGGAATGG，R：CAGGGTGGGATGCTCTT;產物長度187 bp。GAPDH引物：F：CCACTCCTCCACCTTTG，R：CACCACCCTGTTGCTGT;產物長度106 bp。PCR引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

2.2 藥物干預和分組 根據預實驗結果，設立正常對照組、模型組即10 ng/mL TGF-β1處理組、芪歸方有效組分低劑量組即10 ng/mL TGF-β1聯合藥物（黃芪甲苷30 μmol/L+阿魏酸20 μmol/L）處理組、芪歸方有效組分中劑量組即10 ng/mL TGF-β1聯合藥物（黃芪甲苷60 μmol/L+阿魏酸40 μmol/L）處理組和芪歸方有效組分高劑量組即10 ng/mL TGF-β1聯合藥物（黃芪甲苷120 μmol/L+阿魏酸80 μmol/L）處理組、潑尼松對照組即10 ng/mL TGF-β1聯合潑尼松1 umol/L處理組。每組設3個復孔，加藥后充分混勻，培養48 h。

2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 收集細胞，調整細胞懸液濃度，分于96孔板，3×103個細胞/孔，每孔100 μL，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養過夜，使細胞貼壁。按照不同分組處理細胞，繼續培養48 h。取出細胞培養板，向每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續培養4 h。在酶聯免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光值。同時設置調零孔（培養基、CCK8），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解遞質、培養基、CCK8），每組設定3復孔。計算各組細胞的相對增殖率。

2.4 Western blot檢測各組細胞Smad7、SnoN蛋白的表達水平 將需要抽提的蛋白的細胞從培養箱中取出，吸去培液，適量預冷的1×PBS洗滌2次，吸去PBS，低溫高速離心，提取上清總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定細胞蛋白濃度。取等量的總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗Smad7抗體、兔抗SnoN抗體;孵育一抗的膜用PBST洗滌3次，按照1∶10 000稀釋HRP標記的二抗，與膜室溫孵育1 h。將膜放置在暗室中，根據用量取ECL發光液A和B等量混勻，加在膜的正面與之充分接觸。然后將膜置于全自動化學發光分析儀中檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

2.5 RT-PCR檢測各組細胞Smurf2的mRNA水平 ?收集各組細胞，去除培養基;采用TRIzol法提取總RNA，按說明書操作并逆轉錄獲得cDNA。并溶解于無RNase的水中，將制備好的cDNA進行PCR擴增，Smurf2引物：F：CTCGGTTGTGTTCGTCT，R：CTCCCATTGCGTAGTTC，擴增片段大小為279bp;GAPDH引物：F：CCACTCCTCCACCTTTG，R：CACCACCCTGTTGCTGT，擴增片段大小為106;擴增條件為55 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s;60 ℃ 60 s，循環40次;根據公式2-△△CT計算各組不同目的基因表達量。實驗重復3次，反應結束后進行軟件分析。

2.6 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件和GraphPad5.0軟件進行圖表制作，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化模型檢測 ? 以10 ng/mL TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化模型，干預時間分別為24 h、48 h、72 h，通過實時定量PCR儀分別檢測α-SMA這個特異性纖維化指標的mRNA相對表達水平，比較干預不同時間的效果差別，結果如圖1所示：α-SMA的mRNA相對表達水平在48 h出現顯著升高（P<0.01），在72 h較48 h稍有下降（P<0.01），可見MRC-5細胞在TGF-β1誘導下48 h時出現充分纖維化，說明48 h時此模型誘導成功。

3.2 各組細胞增殖情況比較 芪歸方有效組分可抑制TGF-β1刺激引起的MRC-5細胞增殖，與正常對照組比較，10 ng/mL TGF-β1處理組的細胞增殖活性明顯提高（P<0.01），表明TGF-β1能夠促進MRC-5細胞增殖;而經芪歸方有效組分干預，與模型組比較，隨藥物濃度增高，MRC-5細胞增殖活性明顯降低，以中高濃度芪歸方有效組分處理組抑制效果更明顯，差異有統計學意義（P<0.01），表明芪歸方有效組分可抑制TGF-β1刺激引起的MRC-5細胞增殖。見圖2。

3.3 芪歸方有效組分對MRC-5細胞Smad7、SnoN蛋白表達的影響 與空白對照組比較，模型組中Smad7、SnoN蛋白表達明顯減少（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組Smad7、SnoN蛋白表達則相對增加，并隨芪歸方有效組分濃度的增大而升高，其中以芪歸方有效組分中劑量組改善Smad7及芪歸方有效組分高劑量組提高SnoN蛋白水平更顯著（P<0.01）。見表1、圖3。

3.4 各組細胞Smurf2的mRNA水平比較 與空白對照組比較，模型組Smurf2表達水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，芪歸方有效組分及潑尼松組Smurf2表達水平顯著下降（P<0.01）。與潑尼松1 μmol/L處理組比較，芪歸方有效組分中高劑量組Smurf2表達水平顯著降低（P<0.01）。見表2。

4 討論

近年來我國人口老齡化加速，加之空氣質量變差，IPF在我國發生率呈上升趨勢。中醫學無IPF的病名，根據其發生發展過程所表現的證候特點，可歸屬于“肺痹”“肺痿”等病范疇[5]。肺痿從本虛而言，肺氣受損，津液耗傷;肺痹從邪實而言，痹阻不通，氣血失暢。肺為嬌臟，易感受外邪如風寒濕邪氣，客于肺引發痰濁、瘀血停滯于內，久則產生肺痹之征，邪氣膠著不解，損傷人體正氣，肺葉失于濡養，日久而痿。故臨證時當把握住氣虛血瘀的核心病機，氣虛為本，血瘀為標，從氣虛血瘀論治是治療IPF的重要方法。治療時在活血化瘀通絡同時，補虛扶正，黃芪味甘而薄，具補氣之功;當歸味甘而重，故專能補血;其氣輕而辛，故又能行血，且近年來許多體內和體外研究表明黃芪、當歸單藥及其組合用藥等能治療和預防肺纖維化。而黃芪甲苷和阿魏酸為其主要有效活性成分之一，現代研究表明[6]，當歸和黃芪配伍后，復方中的組分絕大部分來源于各單味藥的化學成分，阿魏酸和黃芪甲苷分別是中藥當歸和黃芪的代表性成分，是芪歸方（當歸補血湯）中的主要有效成份。Dong H等[7]取黃芪的有效成分黃芪甲苷和當歸的活性成分阿魏酸，通過利用中效原理（Chou-Talalay聯合指數法）優選了黃芪甲苷和阿魏酸配伍劑量，組成芪歸方有效組分方劑。有多項研究[8]對芪歸方的活性成分（黃芪甲苷和阿魏酸）的含量進行了測定，在芪歸方（黃芪：當歸5∶1，當歸補血湯）制備和純化之后，黃芪甲苷和阿魏酸分別為2∶3。在肺纖維化發病中TGF-β1[9]是公認的最關鍵最直接的多功能促纖維增生細胞因子，在纖維形成過程中起重要作用;其在受累器官中的表達持續升高，會導致細胞外基質（ECM）的反復破壞、修復進而引起肺纖維素的沉積，因此常用于構建肺纖維化細胞模型。肌成纖維細胞以表達α-SMA為特征，在TGF-β1的刺激下合成增多，造成細胞外基質的異常沉積，進一步加速肺纖維化的發展。本實驗采用TGF-β1進行細胞模型的構建，實時定量PCR法檢測結果顯示，模型組細胞增殖水平較正常對照組明顯增高，表達大量的α-SMA，分化明顯，提示造模成功。經不同濃度的芪歸方有效組分處理，MRC-5細胞增殖降低，以芪歸方有效組分中高濃度組作用更為明顯，提示芪歸方有效組分可通過抑制MRC-5的增殖，減緩肺纖維化進展，可能與其抑制ECM異常蓄積有關。

Smad蛋白[10]是TGF-β信號傳導通路中最關鍵的信號轉導因子，是其目的轉錄基因的主要信號傳導蛋白，從而建立起胞膜與胞核之間的信號轉導通路，TGF-β1信號傳導通路發揮效應時大部分需要下游Smad蛋白參與。Smad7[11]可與TGF-βⅠ類受體緊密結合，在TGF-β1刺激后阻止Smads蛋白（Smad2/3）發生磷酸化，是TGF-β信號傳遞的關鍵負調控因子，共同調節α-SMA的表達。SnoN是[12]TGF-β1信號通路的負性調節因子，在組織細胞存活中，SnoN表達的調節有重要作用，與Smad蛋白相互作用，在細胞核和細胞質中均可抑制TGF-β1信號通路的激活、負向調控TGF-β1信號通路，而TGF-β1通過多種方式調節SnoN的表達，利用SnoN靶向調控TGF-β1/Smad信號通路，可抑制組織纖維化的發生發展。研究發現[13]，SnoN過表達的模型可抑制組織細胞纖維化，而減少SnoN的表達則有促進組織纖維化功能。本研究通過Western blot檢測各組細胞Smad7、SnoN檢測發現，TGF-β1處理組Smad7、SnoN蛋白表達水平下降，不同濃度芪歸方有效組分處理TGF-β1誘導的MRC-5后，上調Smad7、SnoN的表達，有效地阻止下游信號轉導，提示芪歸方有效組分可阻斷TGF-β1/Smads在纖維化的信號轉導，降低細胞對TGF-β1的反應性，而起抗肺纖維化的作用。

泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin Proteasome Pathway，UPP）是真核細胞中蛋白質選擇性降解的重要途徑，在TGF-β1/Smad信號傳導通路中，E3泛素連接酶通過選擇性介導Smads蛋白、TGF-β受體等的泛素化降解，在TGF-β1/Smad信號活性的調節中起樞紐作用。Smurf2是泛素連接酶E3的一種，在多種纖維化疾病中表達異常，可選擇性通過泛素化降解Smad7、SnoN、Ski（Sloan-Kettering Institute proto-oncogene）等影響了TGF-β1信號傳導通路，其功能失調會導致TGF-β1/Smad信號傳導異常，參與了纖維化疾病的發生、發展[14]。研究發現，Smurf2與ECM積聚形成IPF密切相關。在TGF-β誘導人肺成纖維細胞活化實驗中，Smurf2[14]促進了TGF-β1/Smad信號通路重要分子TGF-β1的上調表達;而通過RNA干擾技術沉默Smurf2表達，則可見MRC-5細胞α-SMA和CollagenI（I型膠原蛋白）表達下降，Smad7蛋白則可見表達升高，TGF-β1的表達被抑制，推測Smurf2可能通過泛素化降解Smad7和SonN蛋白分子，調控TGF-β1/Smad信號通路;而用泛素蛋白酶體抑制劑MG132可阻止Smad7和SnoN泛素化降解，抑制TGF-β1誘導人肺成纖維細胞活化。本研究顯示，與正常空白組比較，模型組Smurf2蛋白增加，促進Smurf2介導的Smad7、SnoN蛋白發生泛素化降解過程，使Smad7、SnoN蛋白水平降低，不能發揮其負調控IPF的作用，加速IPF進程。既往研究提示Smurf2通過調節Smad信號通路上的負調節因子SnoN和Smad7蛋白的降解，這和以往的研究相符[15]。經芪歸方有效組分干預后，與模型組比較，Smurf2蛋白mRNA水平有下調，阻止Smad7和SnoN進一步泛素化降解，SnoN、Smad7蛋白水平增加，從而上調恢復SnoN、Smad7蛋白水平，延緩IPF。

綜上所述，本研究提示TGF-β1誘導人肺成纖維細胞活化后出現增殖能力下降，并伴SnoN、Smad7蛋白減少，Smurf2升高，芪歸方有效組分能有效抑制體外培養的人胚肺成纖維細胞MRC-5生長，通過阻止Smurf2介導的SnoN、Smad7泛素化，恢復其表達，調控TGF-β1/Smad信號途徑，從而發揮對肺纖維化治療效果，這從新的視角闡明了芪歸方有效組分抑制肺纖維化發生、發展的機制，為進一步深入研究芪歸方抗肺纖維化的作用機制提供了一定基礎。

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（2020-04-25收稿 責任編輯：王楊）