基于血清代謝物的血管內皮功能障礙預測模型研究

血管內皮功能障礙是動脈粥樣硬化性心血管病可檢測到的最早期病理改變，被認為是心血管事件的獨立預測因子[1-2]。如今心血管病已是造成我國居民死亡和疾病負擔的首要原因[3-4]，開展人群血管內皮功能障礙的篩查對于識別心血管病早期危險個體及其早期預防具有重要的現實意義。目前血管內皮功能可靠的無創性評價方法是通過超聲測量肱動脈血流介導的血管舒張功能（FMD）[5]，但FMD 檢測需要專業人員進行操作，對現場檢測環境和受檢者要求較高[6]，并且在現場檢測耗時較長等，導致其在一些人群現場調查中的實施可行性較低。

近年來研究發現，血管內皮功能障礙與內皮細胞代謝密切相關[7-8]，代謝產物如血清尿酸的改變可提示機體血管內皮功能障礙的發生[9]。為此，本研究基于氣相色譜—飛行時間質譜（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry,GC-TOF-MS）技術的非靶標代謝組，檢測血管內皮功能障礙者和正常者的血清代謝物。利用血清差異代謝物構建血管內皮功能障礙預測模型并進行驗證，為識別人群中血管內皮功能障礙的個體提供一種參考方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象

于2015 年在廣西壯族自治區兩鄉鎮現場招募常住居民795 名。納入標準：（1）禁食至少8 h；（2）年齡18～80 歲。排除標準：（1）患有冠心病、外周動脈疾病、腦卒中（22 例）；（2）近3 天服用血管舒張藥、降血脂藥或其他藥物（253 例）；（3）FMD 缺失（7 例）。排除282 人后，兩鄉鎮共納入513 名居民，將其中一個鄉鎮383 名居民按血管內皮功能不同狀態（FMD＜6%為血管內皮功能障礙，FMD≥6%為血管內皮功能正常[10]）分為兩類，按照年齡和性別進行整體匹配，最后共納入77 名居民作為建模組，用以模型構建；從另一鄉鎮130 名居民中抽取26 名作為外驗證組，用以模型外部驗證。共納入103 例研究對象。本研究經廣西醫科大學倫理委員會審批（批準文號：20130306-2），所有研究對象均已被告知研究目的與內容并同意參加研究。

1.2 調查方法

經由統一培訓的調查人員對研究對象進行問卷調查、體格檢查和血樣采集。問卷調查收集研究對象性別、年齡、吸煙、飲酒情況等基本信息，體格檢查獲取身高、體重、血壓，FMD 等資料。現場采集研究對象外周靜脈血4～5 ml，分離血清后，置于-80℃冰箱保存。

1.3 肱動脈FMD 檢測

以超聲測量的肱動脈FMD 為金標準評價研究對象血管內皮功能。FMD 檢測遵循《內皮依賴性血流介導的肱動脈血管舒張的超聲評估指南》[6]，采用血管內皮功能檢測儀（UNEXEF38G，日本）在室溫、安靜、光線較暗的環境下進行檢測。受檢者靜坐休息至少15 min 后進行檢測。檢測時，受檢者處于平臥位，暴露右上臂。將血壓計袖帶縛于右上臂，H 型探頭置于右側手臂肘上約5～10 cm 的肱動脈部位，測量安靜狀態下肱動脈基礎直徑，記為D0。保持探頭位置不變，將血壓計袖帶加壓至高于收縮壓50 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）以阻斷血流，5 min后放開袖帶，測量袖帶放開后30～120 s 內反應性充血最大擴張直徑，記為D1。FMD=[（D1-D0）/D0]×100%。

1.4 血清代謝物測定

代謝物測定參考文獻[11]的方法，取100 μl 血清于1.5 ml 離心管中，加入350 μl 甲醇和20 μl L-2-氯苯丙氨酸（內標），混勻，在4℃下以13 000 轉/min 的轉速離心15 min。取400 μl 上清于2 ml 經甲烷硅基化的進樣瓶中。每個樣本各取4 μl 于新進樣瓶中，混勻，作為質控樣本。真空干燥樣本后，加入50 μl甲氧胺鹽（溶于吡啶，20 mg/ml），輕輕混勻后，置于80℃烘箱中孵育30 min。隨后向樣本中加入70 μl N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含體積比為1%的三甲基氯硅烷），混勻后在70℃烘箱中孵育2 h，將樣本冷卻至室溫。向質控樣本中加入10 μl 飽和脂肪酸甲酯標準混合液（溶于氯仿C8-C16:1 mg/ml；C18-C24:0.5 mg/ml），混勻。

樣本采用Agilent 7890 GC-TOF-MS（Agilent公司，美國）進行檢測，采用不分流模式，進樣量1 μl，載氣為氦氣。前進樣口吹掃流速3 ml/min，柱流速1 ml/min。柱溫：50℃保持1 min，以20℃每分鐘的速率上升至310℃，保持6 min。前進樣口和傳輸線溫度分別為280℃和270℃。離子源溫度220℃，電離電壓-70 eV，掃描方式50～500 m/z，掃描速率20 pectra/s，溶劑延遲366 s。

應用Chroma TOF 4.3X 軟件和LECO-Fiehn Rtx5數據庫對色譜峰進行提取、數據基線過濾和校正、峰對齊、反卷積分析、峰定性和半定量。采用保留時間指數方法進行峰定性，保留時間定性偏差為5 000，采用內標歸一化法進行峰定量。通過LECO/Fiehn 代謝組學庫對代謝物進行鑒定，相似度越高表明代謝物鑒定越準確。

1.5 統計學方法

應用Stata 13.1 軟件進行統計描述和統計分析，符合正態分布的計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以構成比（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

采用SIMCA 14.1 軟件對建模組代謝數據進行主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA），并用200 次置換檢驗判斷OPLS-DA 模型是否過度擬合，由此篩選出血管內皮功能障礙者和正常者的差異代謝物。篩選標準為OPLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection,VIP）值大于1 且兩獨立樣本t檢驗的P值＜0.05。以血管內皮功能是否障礙為因變量（FMD≥6%=0，FMD＜6%=1），以不同的代謝物（經自然對數轉換的相對定量值即代謝物峰面積與內標峰面積之比）組合分別與性別（女=0，男=1）、年齡（連續型變量）作為自變量構建多個Logistic 回歸模型。采用AUC 和Hosmer-Lemeshow 擬合優度檢驗，評價所有Logistic 回歸模型的預測能力和校準能力，以ROC 曲線中最靠近左上角的點為模型最佳截斷點。

利用建模組數據采用十折交叉驗證法對模型進行內部驗證，外部驗證是采用預測模型對外驗證組的研究對象進行預測，分別計算AUC、敏感度和特異度以評價模型預測能力。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者基本特征（表1）

本研究共納入103 例研究對象，其中建模組77例，平均年齡（57.0±6.5）歲，男性37 例（48.1%）；外驗證組26 例，平均年齡（57.0±7.0）歲，男性14例（53.8%）。

表1 兩組受試者基本特征［例（%）］

對建模組和外驗證組受試者的血管內皮功能障礙者和血管內皮功能正常者進行均衡性檢驗。表1顯示，兩組中血管內皮功能障礙者和血管內皮功能正常者在性別、年齡、民族、教育程度、吸煙情況、飲酒情況、高血壓、糖尿病和體重指數（BMI）方面差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

2.2 PCA 與OPLS-DA 分析結果

建模組代謝數據的PCA 分析結果顯示，血管內皮功能障礙者和正常者的得分點存在小部分重疊，區分較顯著。為了獲得更好的組間分離，進一步進行OPLS-DA 分析。由圖1 可看出，所有樣本均處于95%CI 內，兩組樣本得分點完全區分，表明這兩類人群的代謝特征有區別。OPLSDA 模型解釋率（R2Y）和預測率（Q2）分別為0.949和0.720，置換檢驗R2和Q2截距分別為0.825和-0.437，表明OPLS-DA 模型可以很好地解釋血管內皮功能障礙者和正常者之間的差異性，且不存在過度擬合現象。

圖1 建模組正交偏最小二乘法-判別分析得分圖（n=77）

2.3 建模組中血管內皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物（表2）

根據建模組OPLS-DA 分析得出的VIP 值，結合兩獨立樣本t檢驗，篩選出血管內皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物共16 個。與血管內皮功能正常者相比，血管內皮功能障礙者的尿酸、色氨酸、松香酸、蔗糖、果糖、花生酸、β-胸苷、谷氨酸、棕櫚油酸、2-甲基戊酸、百里香酚水平相對降低（變化倍數＜1），而尿素、阿拉伯糖醇、尿苷、胞苷酸、來蘇糖酸,1,4-內脂的水平相對升高（變化倍數＞1）。

2.4 預測模型建立與評價（表3）

通過構建不同Logistic 回歸模型并進行評價與比較，按功效最優原則，其中由性別、年齡、尿酸、色氨酸和尿素為組合的模型在模型構建、內部驗證和外部驗證時的AUC 值均較大，且擬合優度檢驗差異無統計學意義（P＞0.05），表明該模型的預測能力和校準能力均較好，確定為本研究預測模型。模型表達式為P=1/{1+exp[-（9.803-0.777×性別-0.204×年齡-0.343×ln 尿酸+0.024×ln 色氨酸+0.808×ln尿素）]}，其中P為發生血管內皮功能障礙的概率預測值。

預測模型AUC 為0.974，95%CI 為0.945～1.000。以ROC 曲線中最靠近左上角的點為模型最佳截斷點，其對應的概率預測值為0.666，敏感度和特異度分別為93.8%和93.3%。

表2 建模組中血管內皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物

表3 建模組中血管內皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物組合及模型構建

2.5 預測模型驗證

建模組十折交叉驗證（內部驗證）平均AUC 為0.922（95%CI：0.847～0.997），敏感度和特異度分別為87.5%和91.1%（圖2）。十折交叉驗證AUC 與模型構建AUC 比較差異無統計學意義（P=0.07），提示預測模型具有良好的穩定性。

運用建立的預測模型對外部驗證組26 例受試者進行血管內皮功能障礙預測。若P值≥0.666，則判定為血管內皮功能障礙，反之則判定為血管內皮功能正常。在金標準判定的12 例血管內皮功能障礙者中，模型判定正確11 例，錯分為血管內皮功能正常者1 例；在金標準判定的14 例血管內皮功能正常者中，模型判定正確11 例，錯分為血管內皮功能障礙者3 例。外部驗證AUC 為0.881（95%CI：0.729～1.000），敏感度和特異度分別為91.7%和78.6%（圖2），表明模型的預測能力較好。

圖2 預測模型內部驗證和外部驗證散點圖

3 討論

血管內皮功能障礙的分子病理主要表現為一氧化氮（NO）生物利用度降低[12]，并常伴隨氧化應激增加和炎癥反應[13]。尿素是鳥氨酸循環的代謝產物，由精氨酸酶催化精氨酸生成。研究已表明，在動脈粥樣硬化等以血管內皮功能障礙為特征的疾病中，精氨酸酶活性增強[14-15]，尿素合成增多，而NO 合酶利用精氨酸生成NO 減少。尿酸是體內一種強抗氧化劑，能清除自由基，維持抗氧化酶（超氧化物歧化酶）的活性[9]。此外，尿酸可與過氧亞硝酸鹽結合，防止NO 合酶必需輔酶因子—四氫生物蝶呤被氧化[16]。有研究報道，低水平尿酸可能通過增加氧化應激和減少NO 生成而導致血管內皮功能障礙[17]。色氨酸是人體必需氨基酸，在體內主要通過犬尿氨酸途徑分解代謝。吲哚胺2,3 雙加氧酶（IDO）是控制色氨酸代謝的限速酶[18]。有研究表明，IDO 在炎癥反應中上調[19]，色氨酸分解代謝增強，致其水平降低。因而，血清尿素、尿酸及色氨酸的改變可能與血管內皮功能障礙的分子病理有關。

血管內皮功能評價方法分為有創性和無創性，有創性方法包括冠狀動脈內注入血管活性物質，血管內超聲等。此類方法可直接評估內皮功能，測量結果可靠，但因為是有創操作并且設備昂貴，使其廣泛應用受到限制[20]。目前血管內皮功能評價主要以無創性方法為主，常用的方法主要包括FMD，外周動脈張力測定法（peripheral arterial tonometry,PAT），脈搏波傳導速度（PWV）檢測。FMD 檢測因具有無創性、安全性、可重復性的特點，以及對心血管病具有較好的預測價值而成為最常用的無創技術手段，但同時該檢測也存在設備昂貴、對操作者要求高、操作較為復雜與費時等不足[20-21]。PAT 的技術原理與FMD 相似，具有自動化檢測和對操作者依賴性小的優勢，不足之處在于易受外界環境和自主神經張力的影響[22]，檢測的敏感度和重復性不如FMD[23]。PWV 是通過測量體表兩個動脈搏動點之間的搏動傳導速度評價內皮功能，該方法操作簡便，自動化程度高，但其檢測過程費時，重復性較低[24]。

雖然評價血管內皮功能的方法眾多，但尚未有一種方法能同時滿足群體性現場調查中簡便、省時、不易受外界環境干擾的需求。目前也尚未發現對血管內皮功能障礙進行預測的相關報道。本研究通過GC-TOF-MS 技術檢測血清中代謝物，建立了由性別、年齡、尿酸、色氨酸和尿素為組成的血管內皮功能障礙預測模型，模型總體上具有較好的穩定性和預測能力。GC-TOF-MS 技術可同時對多樣本多組分進行檢測，樣本平均檢測時間和檢測成本均較低。在實際應用中，只需獲取血液樣本進行檢測即可預測，在一定程度上減少了對現場檢測環境的依賴。

本研究存在以下不足。首先，用于模型構建和驗證的樣本量較少，將來預測模型仍需要更大的樣本量在不同特征的群體中進行驗證。其次，本次研究對象的納入標準為18～80 歲人群，但實際入組研究對象的平均年齡為（57.0±6.6）歲，并且主要是鄉鎮居民，因此該預測模型在應用于年齡較小人群或城市居民時，可能存在一定的局限性。

綜上所述，本研究構建的以性別、年齡、尿酸、色氨酸和尿素為組合的血管內皮功能障礙預測模型具有良好的穩定性和較強的預測能力。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突