尼氟滅酸抑制人腦膠質瘤U87細胞活力、遷移及侵襲*

崔萬麗， 石雨淑雅， 蔡欣池， 田 晶△

（吉林醫藥學院 1生理學教研室，22016級臨床醫學教改班，吉林吉林132013）

尼氟滅酸（niflumic acid，NFA）是一種常用的解熱鎮痛藥，經常用于痛經、類風濕關節炎和骨關節炎的治療，通過抑制環氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）發揮作用；同時，它也可以特異性阻斷氯通道［1］，影響細胞的增殖［2］和凋亡［3］等。膠質瘤是顱內最常見的腫瘤，其極強的侵襲性是導致膠質瘤術后復發率高的主要原因之一［4］。報道顯示惡性膠質瘤高表達COX-2［5］，也有報道膠質瘤的惡性程度與氯通道數量呈正相關［6-8］，而NFA 對膠質瘤的作用尚不清楚。本研究觀察氯通道阻斷劑NFA 對人膠質瘤U87細胞活力、遷移和侵襲的作用，并初步探討其作用機制，為臨床治療提供參考資料。

材料和方法

1 細胞株、主要試劑和儀器

人膠質瘤U87 細胞株由吉林大學第一醫院神經外科提供。NFA和MTT購自Sigma；胰蛋白酶和小牛血清購自Gibco；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自 Thermo。NFA 用 DMSO 配制成濃度為0.1 mol/L 的原液備用，于4℃保存，實驗時再用培養液稀釋至所需濃度。CB150 型CO2培養箱為Binder公司產品；CA92121 型實時無標記細胞分析（realtime cell analysis，RTCA）儀DP 系統為杭州艾森生物有限公司產品。

2 方法

2.1 細胞培養和分組 自液氮罐中取出凍存的U87 細胞，37℃水浴振蕩溶解，用含10%小牛血清的DMEM 培養液混勻后置于75 cm2培養瓶中，于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下進行培養，隔日換液，隔2～3 d 傳代1 次，取生長狀態良好處于對數生長期的U87細胞隨機分為對照組和不同濃度NFA處理組。

2.2 MTT 法檢測U87 細胞活力 取對數生長期的U87 細胞，0.25%胰酶消化后，用含5%小牛血清的DMEM 培養液重懸細胞，調整細胞濃度為5×107/L。將細胞均勻接種于96 孔板中，每孔100 μL，置入37℃、5% CO2細胞培養箱中進行培養。24 h 后加入NFA（終濃度分別為0、25、50、100和200 μmol/L），每個濃度5 個復孔，分別作用12、24 和48 h，每孔再加入MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h，棄上清后每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min，全自動酶標儀 490 nm 波長處測定各孔吸光度（A）值，并計算細胞相對活力。細胞相對活力（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.3 RTCA 法檢測細胞遷移［9］遷移侵襲檢測板下室的孔中加入165 μL 含10%小牛血清的培養基，上室中加入30 μL 無血清培養基，輕拍板四周，使培養基分布均勻，置于37℃、5%CO2細胞培養箱平衡1 h。將測好基線的檢測板取出，在上室孔中加入100 μL混合均勻的無血清細胞懸液，使每孔中細胞數目分別為5×104個。檢測板置于超凈臺中室溫放置30 min 后，放到培養箱中的RTCA Station 上，系統自動掃描后，間隔15 min 測量細胞指數一次，共檢測72 h。細胞遷移曲線由RTCA 儀自動生成，采取12、24、48 和72 h 4 個時點細胞指數的后臺數據計算細胞遷移率。細胞遷移率（%）=實驗組細胞指數/對照組細胞指數×100%。

2.4 RTCA 法檢測細胞侵襲［9］實驗前將基質膠從-80℃移至4℃融化。用預冷的無血清培養基按1∶40稀釋基質膠，冰上操作，以防基質膠凝固。先在遷移侵襲檢測板上室中加入50 μL稀釋好的基質膠，再吸出 30 μL 的基質膠，孔中留 20 μL 的基質膠包被檢測板上室。放置在37℃中至凝固，凝固時上室置于檢測板夾具上，保證懸空不觸及電極。下室孔中加入160 μL 含10%小牛血清的DMEM 培養基，在上室放入30 μL 的無血清培養基，將裝置置于37℃、5%CO2細胞培養箱平衡1 h。將培養好的細胞取出后，進行消化、離心，無血清培養基配制成需要的細胞濃度。上室孔中加入100 μL 混合均勻的無血清細胞懸液，每孔中細胞數為5×104個。將檢測板置于超凈臺中室溫放置30 min 后，放在培養箱中的RTCA Station上，系統自動掃描后，間隔15 min 檢測一次細胞指數，共檢測72 h。細胞侵襲曲線由RTCA 儀自動生成，采取 12、24、48和72 h 4 個時點細胞指數的后臺數據計算細胞侵襲率。細胞侵襲率（%）=實驗組細胞指數/對照組細胞指數×100%。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。細胞相對活力、細胞遷移率及細胞侵襲率的數據均呈正態分布，以均數±標準差（mean±SD）表示，組間均數比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 U87細胞的活力

NFA 作用膠質瘤 U87 細胞 12 h 后，與空白對照組比較，各濃度組細胞活力均增強（P＜0.05 或P＜0.01）；與空白對照組比較，NFA 作用 24 h 后，100 和200 μmol/L NFA 組細胞活力顯著降低（P＜0.05）；NFA 作用 48 h 后，50、100和200 μmol/L NFA 組細胞活力均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），并呈現濃度依賴性，見表 1。由于 100和200 μmol/L NFA 組細胞活力受到顯著抑制，因此后續研究采用這兩個濃度進行干預。

2 各組U87細胞的遷移情況

RTCA 檢測結果表明，各組U87 細胞均發生遷移。與空白對照組比較，12 h 時 200 μmol/L NFA 組細胞遷移率就顯著降低（P＜0.05），24 h 后更加顯著（P＜0.01），100 μmol/L NFA 組在48 h 后細胞遷移率顯著降低（P＜0.01），200 μmol/L NFA 組細胞遷移率低于100 μmol/L NFA 組（P＜0.01），具有一定的濃度依賴性，見圖1及表2。

表1 各組U87細胞活力Table 1.The viability of the U87 cells in various groups（%.Mean±SD. n=5）

Figure 1.Migration curves of the U87 cells.圖1 U87細胞遷移曲線

3 各組U87細胞的侵襲情況

RTCA 結果表明，各組U87 細胞均可以穿過基質膠發生侵襲，與對照組相比，48 h 時 100和200 μmol/L NFA 組細胞侵襲率顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），200 μmol/L NFA 組細胞侵襲率低于 100 μmol/LNFA組（P＜0.01），見圖2及表3。

Figure 2.Invasion curves of the U87 cells.圖2 U87細胞侵襲曲線

表3 各組U87細胞的侵襲率Table 3.Invasive rates of the U87 cells in different groups（%.Mean±SD. n=3）

討 論

根據組織病理學的特征膠質瘤分為4 級，Ⅰ和Ⅱ級為低級別膠質瘤，這兩型分化好，相對良性，5年生存率可達59.9%［10-11］；Ⅲ和Ⅳ級為高級別膠質瘤，均為惡性。Ⅳ級膠質瘤又稱膠質母細胞瘤，它具有高度增殖性和侵襲性，且易復發、預后差，兩年生存率可低至3.3%［10-11］。膠質瘤的侵襲能力強導致其易復發，是影響其預后的主要因素。COX-2 在惡性膠質瘤表達增加并與患者生存期縮短有關［5］。COX-2受表皮生長因子受體信號轉導的調控，通過誘導轉錄調控因子 Id1 增強 GBM 細胞的惡性程度［5］。腫瘤細胞在增殖、遷移和侵襲前都有容積的變化。當細胞處于低滲環境時，位于胞膜上的容積激活性鉀通道與氯通道會開放，通過K+和Cl-的外流，帶動水的流出，可使細胞體積變小，這一過程稱為調節性容積減?。╮egulatory volume decrease，RVD）。RVD 在細胞增殖、分化、凋亡和遷移等過程中非常重要。在膠質瘤細胞，RVD 功能尤其強大。研究表明，正常腦細胞內Cl-濃度約6～10 mmol/L，由于膠質瘤高表達Na+-K+-2Cl-轉運體1 使細胞內Cl-濃度可高達80～100 mmol/L，具有明顯的外流趨勢［12］。膠質瘤細胞內Cl-或者K+通過離子通道或轉運蛋白外流，從而帶動水的外流，使細胞容積變小，使膠質瘤能夠穿過狹窄的縫隙，發生遷移［12］。

據報道，長期使用非甾體抗炎藥可降低結直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌和胃癌的發病率［13］，能誘導多種腫瘤細胞的凋亡并抑制遷移［13］。NFA 作為一種非甾體抗炎藥，近年來發現能抑制多種腫瘤細胞的增殖［2］。大多數非甾體抗炎藥對COX-1和COX-2有較強的抑制作用。抑制COX-2 可以抑制腫瘤的血管生成并促進凋亡［14］。然而，非甾體抗炎藥的抗腫瘤作用可能不僅是通過抑制COX-2 活性來介導的。因為，首先非甾體抗炎藥誘導細胞凋亡的濃度明顯高于COX-2抑制所需的濃度［15］；其次非甾體抗炎藥不僅抑制COX-2 表達細胞的生長，而且抑制COX-2 缺陷細胞系的生長［16］。NFA 是COX-2的選擇性抑制劑，同時，它也是氯通道的阻斷劑，可以特異性地阻斷鈣激活氯通道、囊性纖維跨膜電導調節體和容量調控氯通道［2］。研究發現多種氯通道阻斷劑如NPPB、氯毒素、9-蒽羧酸等都可以抑制腫瘤細胞的增殖［17］。

本研究檢測了NFA 對人膠質瘤U87細胞增殖的影響，結果顯示NFA在12 h時表現為促進增殖作用，作用24 和48 h 時抑制膠質瘤細胞的增殖。進一步用RTCA 法檢測了NFA 對膠質瘤細胞遷移和侵襲的影響，顯示100和200 μmol/L NFA 在作用24 h和48 h可以明顯地抑制膠質瘤的遷移和侵襲，作用具有時間和劑量依賴性。NFA 對膠質瘤遷移和侵襲的抑制程度大于對細胞增殖的抑制程度，尤其是48 h 更為顯著，說明NFA 抑制膠質瘤的遷移和侵襲不是或不僅是通過抑制細胞增殖起作用的。氯通道種類繁多，目前研究傾向于認為，鈣激活的氯通道家族中ClC-3參與了膠質瘤細胞的增殖、遷移與侵襲［18］。鈣/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）可 以激活 ClC-3［18-20］。短期內阻斷氯通道，可以使細胞內Ca2+代償性增多從而促進細胞增殖［21］，這可能是NFA 短期作用時促進細胞增殖的原因。膠質瘤細胞緩激肽受體2（bradykinin receptor 2，B2R）的表達量與腫瘤惡性度正相關［21-22］。腦膠質瘤細胞通過血管內皮細胞釋放的緩激肽的趨化作用沿血管外壁遷移。抑制氯通道后，緩激肽的趨化作用消失［21-22］。因此推測，緩激肽與B2R 結合，可以引起細胞內Ca2+的增加，通過CaMKII 激活ClC-3 氯電流，從而引起細胞容積變小而發生遷移。NFA 是通過抑制COX-2還是通過阻斷ClC-3 抑制細胞增殖、遷移和侵襲，還需要我們進一步研究證實。阻斷氯通道可以抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，這為膠質瘤的治療提供了研究方向。