姜黃素通過上調miR-124抑制牙齦卟啉單胞菌LPS誘導的人牙齦成纖維細胞炎癥反應*

李坤陽， 陳 棟， 左春然， 劉愛群， 朱蘭省， 牛 兵 △

［1河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）口腔科，河南鄭州450001；2鄭州大學第一附屬醫院（河南省口腔醫院）口腔科，河南鄭州450052］

牙周病是菌斑微生物引發的感染性疾病，其中牙周炎是成人失去牙齒主要原因，不僅影響牙周組織健康、引發神經炎癥增加，還與糖尿病、腦血管疾病和阿爾茨海默氏病的關系密切［1］，影響患者健康。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）作為牙周炎主要致病菌，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是主要毒力因子，可導致牙周組織細胞破壞，加重牙周炎病程［2］。減少Pg LPS 的毒性作用對于緩解牙周炎至關重要。姜黃素（curcumin，Cur）是從姜黃中提取的酚類色素，具有抗炎和抗氧化等多種作用，在人牙髓干細胞中可促進組織修復［3］；可緩解LPS誘導成骨細胞線粒體功能改變，并且使細胞凋亡數目明顯減少［4］。微小 RNA-124（microRNA-124，miR-124）是一個重要的炎癥相關miRNA，可抑制下游核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）活化發揮抗炎作用［5］。Cur 是否影響miR-124 的表達進而影響炎癥作用尚未發現報道。本研究采用Pg LPS誘導人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）建立HGFs 炎癥模型，探究Cur對HGFs炎性反應的影響。

材料和方法

1 細胞

HGFs購自貝納生物（編號BNCC339845）。

2 藥品、試劑及儀器

Pg LPS和Cur 均購自 R&D Systems（貨號分別為ATCC33277 和C1385G）；免疫細胞化學染色試劑盒購自Protein（貨號為BPICC30-1KT）；抗波形蛋白、角蛋白、NF-κB p-p65、骨架蛋白（F-actin）、GADPH和lamin B1 抗體，白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒均購自Abcam（貨號分別為ab92547、ab155078、ab222494、ab112127、ab181602、ab220797、ab1793 和ab9722）；CCK-8 試劑盒（貨號為C0037）購自碧云天生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒、miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit和2× SYBR qPCR Mix 均購自天根生化科技（北京）有限公司（貨號分別為 DP405、KR211和KR108）；核蛋白和胞漿提取試劑盒購自上海吉凱基因化學技術有限公司（貨號為KGF1100）。CO2培養箱購自上海精密儀器有限公司（型號為LRH-70F）；酶標儀購自賽默飛世爾科技有限公司（型號為Varioskan LUX）；實時熒光定量PCR 儀購自ABI（型號為7500）；蛋白凝膠成像儀購自BIO-RAD（型號為GelDoc 2000）。

3 方法

3.1 實驗分組 將HGFs 分為對照（control）組、LPS組和 LPS+Cur（20、40 和80 μmol/L）組。除 control 組外，其余各組用 10 mg/L LPS［6］處理，同時各 LPS+Cur組分別添加 20、40和80 μmol/L Cur 置于 CO2培養箱中培養。

3.2 CCK-8法檢測細胞活力 按3.1方法各組細胞置于96孔板中，分別培養24 h，添加CCK-8試劑，CO2培養箱中繼續培養2 h，酶標儀檢測450 nm 處各孔細胞吸光度（A）值。每個樣品做6個重復。

3.3 ELISA 檢測上清液中炎癥因子 IL-1β和TNF-α水平 按3.1 方法處理各組細胞，置于6 孔板中培養24 h，收集細胞培養液，3 000 r/min離心5 min收集上清，分裝后置于4℃冰箱待用。嚴格按照人IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒說明書檢測上清液中 IL-1β 和TNF-α水平。

3.4 RT-qPCR 法檢測細胞中miR-124 的水平 收集完細胞培養液后用RNA 提取試劑盒提取細胞的總RNA，miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit 將其逆轉錄成第1 鏈cDNA。采用RT-qPCR 實驗對miR-124 和內參照 U6 進行擴增，反應體系為 10 μL 2×SYBR qPCR Mix、1 μL 40 mg/L cDNA、各0.5 μL 上、下游引物（10 μmol/L）和8 μL ddH2O。反應條件為：95℃ 30 s；95℃ 30 s，62℃ 35 s，45個循環。miR-124的上游引物序列為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAG -TACA-3'，下游引物序列為5'-GGTGGCTTATGTTTGTAATCCC-3'；U6 的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2-ΔΔCt法計算 miR-124 的相對表達水平。

3.5 Western blot 檢測細胞胞漿和胞核中NF-κB pp65 蛋白的水平 按3.1 方法處理各組細胞，置于6孔板中培養24 h，收集細胞置1 mL 離心管中，PBS 重懸清洗細胞，500×g離心5 min，移去上清液，加入預冷的胞漿提取試劑Ⅰ充分震蕩直至離心管中出現均勻無殘留細胞團塊得到渾濁液體，振蕩器上震蕩15 s 后冰上放置10 min，加入胞漿提取試劑Ⅱ混勻，4℃、16 000×g離心5 min，立即取上清液為胞漿，立即吸出至新的EP 管中保存待用。加入預冷的核蛋白提取試劑震蕩混勻，振蕩器上震蕩15 s 后冰上放置10 min，重復4次，4℃、16 000×g離心5 min，立即取上清液為胞核，立即吸出至新的EP 管中保存待用。凝膠電泳分離蛋白質后轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應加入I 抗［NF-κB p65、內參照GADPH（胞漿）和lamin B1（胞核）］，4℃孵育過夜；加入對應Ⅱ抗，室溫孵育1 h。DAB 顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

3.6 激光共聚焦顯微鏡檢測NF-κB p-p65蛋白入核情況 按3.1 處理各組細胞24 h 后的爬片，加入無水乙醇固定 30 min，PBS 清洗，200 μL 4%Triton 靜置15 min，滴加NF-κB p-p65（綠色熒光）和F-actin（紅色熒光）單克隆抗體，室溫孵育1 h，PBS 清洗，加入DAPI后室溫孵育5 min，PBS清洗，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.7 過表達miR-124 檢測細胞胞漿和胞核中NF-κB p-p65 蛋白的水平 在上述實驗基礎上添加mimic-NC 組和 miR-124 mimic 組，各組 10 mg/L LPS處理并同時添加mimic-NC 和miR-124 mimic，其余培養條件與3.2 培養過程相同，檢測control 組、LPS 組、mimic-NC 組和 miR-124 mimic 組細胞中 miR-124 的水平，并檢測細胞胞漿和胞核中NF-κB p-p65蛋白的水平，實驗方法同3.4和3.5。

4 統計學處理

用統計學軟件SPSS 25.0 和GraphPad 8.0 進行數據分析，計量數據以均數±標準差（mean±SD）描述，多組間比較采用方差分析，各組均數間的兩兩比較采用SNK-q法。當P＜0.05 時認為差異有統計學意義。

結 果

1 Cur對細胞活力的影響

LPS 組細胞的活力水平低于 control 組（P＜0.05）；LPS+Cur（40和80 μmol/L）組細胞的活力高于LPS組（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.Comparison of viability in each group after the cells were treated for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖1 各組細胞處理24 h活力的比較

2 Cur 對細胞上清液中 IL-1β和TNF-α 水平的影響

LPS 組細胞上清液的 IL-1β和TNF-α 水平高于control 組（P＜0.05）；LPS+40 μmol/L Cur 組細胞上清液的 TNF-α 及 LPS+80 μmol/L Cur 組細胞上清液的IL-1β和TNF-α水平低于LPS組（P＜0.05），見圖2。

3 Cur對細胞中miR-124水平的影響

LPS 組細胞的 miR-124 水平低于 control 組（P＜0.05）；LPS+Cur（40和80 μmol/L）組細胞的miR-124水平高于LPS組（P＜0.05），見圖3。

4 Cur對細胞中NF-κB p-p65蛋白的影響

LPS組細胞漿的NF-κB p-p65蛋白水平低于control 組（P＜0.05）；LPS+Cur（40和80 μmol/L）組細胞漿的NF-κB p-p65蛋白水平高于LPS 組（P＜0.05），見圖 4。LPS 組細胞核的 NF-κB p-p65 蛋白水平高于control 組（P＜0.05）；LPS+Cur（40 和80 μmol/L）組細胞核的NF-κB p-p65 蛋白水平低于 LPS 組（P＜0.05），見圖5。

Figure 2.Comparison of the IL-1 β and TNF-α levels in the supernatant of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖2 各組細胞上清液的IL-1β和TNF-α水平比較

Figure 3.Comparison of miR-124 levels in the cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖3 各組細胞的miR-124水平的比較

5 Cur對細胞中NF-κB p-p65位置的影響

NF-κB p-p65 顯示為綠色，F-actin 顯示為紅色。圖 6 中 Merged 1 顯示組合的 NF-κB p-p65和F-actin，Merged 2顯示組合的NF-κB p-p65、F-actin和核染色。control 組細胞核的 NF-κB p-p65 較少；LPS 組細胞核的 NF-κB p-p65 明顯高于 control 組；與 LPS 組相比，LPS+Cur（20、40和80 μmol/L）組細胞核的 NF-κB pp65 減少；且隨著 Cur 劑量升高，細胞核的 NF-κB pp65減少，見圖6。

6 過表達miR-124細胞中miR-124表達水平

LPS 組和 mimic-NC 組細胞的 miR-124 水平低于control 組（P＜0.05）；miR-124 mimic 組細胞的 miR-124水平高于LPS 組和mimic-NC 組（P＜0.05），見圖7。

Figure 4.The protein level of NF-κB p-p65 in the cytoplasm of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖4 各組細胞細胞漿的NF-κB p-p65蛋白水平的變化

Figure 5.The protein level of NF-κB p-p65 in the cell nucleus of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖5 各組細胞細胞核的NF-κB p-p65蛋白水平的變化

Figure 6.The changes of NF-κB p-p65 in the cells of each group（DAPI double staining，the scale bar=100 μm）.圖6 各組細胞中NF-κB p-p65的變化

Figure 7.Comparison of miR-124 levels in the cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖7 各組細胞的miR-124水平的比較

7 過表 達 miR-124 細胞的 NF-κB p-p65 蛋白 的影響

LPS 組和 mimic-NC 組細胞漿的 NF-κB p-p65 蛋白水平低于control 組（P＜0.05）；miR-124 mimic 組細胞漿的NF-κB p-p65 蛋白水平高于LPS 組和mimic-NC 組（P＜0.05），見圖 8。LPS 組和 mimic-NC 組細胞核的NF-κB p-p65蛋白水平高于control組（P＜0.05）；miR-124 mimic 組細胞核的 NF-κB p-p65 蛋白水平低于LPS組、mimic-NC組（P＜0.05），見圖9。

討 論

牙周疾病涉及宿主免疫反應的激活，不僅充當牙周組織抵抗細菌侵襲的防御者，而且還充當組織破壞的介體，影響機體健康［7］。牙菌斑生物膜中微生物引起的牙周支持組織慢性感染疾病會導致牙周支持組織發生炎癥和牙周袋形成；進一步導致進行性附著喪失和牙槽骨吸收，牙周骨喪失［8］，影響患者牙齒健康。Cur 具有抗炎和抗腫瘤等作用，同時低毒、安全、耐受性好［9］；在線結扎誘導大鼠實驗性牙周炎模型中可抑制牙齦炎癥，對牙周組織起保護作用［10］，但在人中尚未發現相關研究。

Figure 8.The protein level of NF-κB p-p65 in the cytoplasm of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖8 各組細胞細胞漿的NF-κB p-p65蛋白水平的變化

Figure 9.The protein level of NF-κB p-p65 in the cell nucleus of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖9 各組細胞細胞核的NF-κB p-p65蛋白水平的變化

IL-1β 屬典型致炎因子，可促進炎癥反應，在牙周炎中高表達，可作為治療牙周炎抗炎效果的標志物［11］；TNF-α 參與炎癥反應和免疫反應，可激活破骨細胞活性促進牙槽骨吸收從而損害牙周組織［12］。IL-1β和TNF-α 協同刺激可抑制破骨細胞增殖、分化。本研究發現LPS 組細胞活力低于control 組，提示Pg LPS 誘導HGFs 后抑制細胞活力，細胞生長受到影響。Pg LPS 誘導 HGFs 可使細胞上清液中 IL-1β 和TNF-α 水平升高，提示 IL-1β和TNF-α 可能損害HGFs 導致細胞炎癥嚴重，進而影響細胞生長。Cur處理Pg LPS 誘導的HGFs，隨著劑量增加，細胞活性逐漸恢復，上清液中 IL-1β和TNF-α 水平逐漸降低，提示 Cur 可以減少 IL-1β和TNF-α 釋放從而緩解炎癥作用，但具體機制尚不清楚。

NF-κB 可參與應激反應、免疫和炎性疾病等過程，在牙周炎中可誘導炎癥因子表達從而發揮促炎作用［13］。NF-κB 特異性藥理抑制劑加入變形鏈球菌共培養的HGFs 可促進細胞增殖和膠原合成從而改變細胞活力和黏附性，改善 HGFs 狀態［14］。IL-1β 和TNF-α 激活表面的細胞因子受體導致NF-κB 從細胞質轉移向細胞核，從而促進炎癥介質表達，促進炎癥反應［15］；活化 TNF-α 激活 NF-κB 信號通路進而抑制牙周膜干細胞成骨分化導致組織受損［16］。若將NF-κB 抑制在細胞漿中將會下調NF-κB 活化水平從而抑制炎癥發生。本研究發現LPS 組細胞漿中NF-κB p-p65 蛋白水平低于 control 組，細胞核中 NF-κB pp65蛋白水平高于control組，激光共聚焦顯微鏡同樣發現LPS 組NF-κB p-p65 蛋白向核轉移較明顯，提示可能是由于IL-1β 和TNF-α 等促炎因子的刺激導致NF-κB 從細胞質轉移向細胞核發揮炎癥作用和抑制HGFs生長。Cur處理Pg LPS 誘導的HGFs，隨著劑量增加，細胞漿中NF-κB p-p65 蛋白水平升高、細胞核中 NF-κB p-p65 蛋白水平降低，NF-κB p-p65 活性被抑制從而減緩炎癥反應，緩解疾病。

miRNA 在炎癥中研究廣泛，外傷性腦損傷后小膠質外泌體中miR-124 的增加抑制神經元炎癥［17］；miR-124 可通過NF-κB 信號通路調節鼻咽癌細胞增殖和凋亡［18］；在Amadori糖化白蛋白誘導的視網膜小膠質細胞活化和炎癥中miR-124 表達下調，下調miR-124 表達可刺激NF-κB p65 磷酸化并誘導視網膜小膠質細胞釋放TNF-α 從而加重炎癥反應［19］。本研究發現LPS組細胞中miR-124水平低于control 組，提示 miR-124 在 Pg LPS 誘導 HGFs 中表達下調，促進炎癥反應，可能是 miR-124 下調促進 NF-κB p-p65 活化誘導炎癥因子 IL-1β和TNF-α 激活并釋放，IL-1β和TNF-α 激活后進一步促進NF-κB 從細胞質轉移向細胞核加重炎癥反應。Cur處理Pg LPS誘導的HGFs后miR-124 水平升高，且進一步發現，miR-124 mimic組細胞漿中NF-κB p-p65 蛋白水平高于LPS 組，細胞核中 NF-κB p-p65 蛋白水平低于 LPS 組，Cur 處理與過表達miR-124 功能類似，均可高表達miR-124 從而緩解上述過程從而實現對HGFs的保護。

綜上所述，Cur 可能通過上調miR-124 進而抑制NF-κB p-p65入核實現對Pg LPS誘導的HGFs炎性反應的保護。但Cur 藥理機理復雜，miR-124 有多個調控位點，Cur 具體影響miR-124 調控位點尚未清楚，也是接下來研究重點。