山東煙區首次發現番茄斑萎病毒侵染

張萬紅，馮 佳，ALI Kamran，羅健達，楊舉田，王術科，宗 浩，申莉莉，李 瑩，王鳳龍，張石飛，楊金廣*，金 軻

[1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.山東臨沂煙草有限公司，山東 臨沂 276001；3.山東濰坊煙草有限公司，山東 濰坊 261061；4.紅云紅河煙草（集團）有限責任公司，昆明 650231；5.恩施市煙葉分公司，湖北 恩施 445000]

煙草（Nicotiana tabacum）是一種重要的經濟作物，在山東省種植面積較大。病毒病是一類嚴重危害煙草品質及產量的病害，由于其防治困難，發病嚴重，往往造成巨大的經濟損失。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）屬于布尼亞病毒目（Bunyaviridae）正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus），是布尼亞病毒目唯一侵染植物的病毒屬。TSWV 由薊馬取食傳播，其中西花薊馬（Frankliniella occidentalis）是主要傳播介體。西花薊馬于19 世紀在美國發現，并逐漸發展成為世界性的害蟲之一，在我國山東、云南等多個省份均有發現且為害嚴重[1-2]。

TSWV 寄主范圍廣泛，在番茄、馬鈴薯、辣椒、花生等作物上均有發現[3-4]，是危害植物的十大病毒之一[5]。1951 年首次在澳大利亞發現TSWV 的侵染為害[6]，隨后在美國、韓國、巴西等國家發現[7-9]，并在中國云南、北京、黑龍江等多個省市地區的許多作物上均有發現[10-13]。

筆者所在研究團隊前期通過siRNA 測序技術對山東不同煙區的煙草病毒病侵染種類進行了初步測定，在山東臨沂樣品中發現了疑似TSWV 的侵染。為進一步明確TSWV 在山東煙區的侵染現狀，參照文獻[7]的TSWV 分離物基因組序列設計引物，分段法克隆得到該分離物的全基因組序列，明確該分離物的基因組結構特性和遺傳進化情況，顯示其屬于TSWV 的一個分離物。基于山東臨沂分離物序列信息設計了TSWVN基因的特異性引物，建立RT-PCR 檢測體系，本研究為番茄斑萎病毒的精準測報與防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試樣品為山東省臨沂市平邑縣疑似受TSWV 侵染的典型性狀煙草葉片，于2019 年6 月采集。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取 將發病煙葉液氮冷凍處理后研磨成粉末，加入1 mL Trizol Reagent 后混勻，室溫靜置5 min。加入200 μL 三氯甲烷，上下劇烈振蕩15 s，4 ℃靜置5 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min。取上層水相并加入等體積異丙醇，混勻，4 ℃靜置10 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入75%乙醇，振蕩使沉淀懸浮，洗滌沉淀。4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min，棄上清，瞬離，吸出多余乙醇，4 ℃放置超凈臺中干燥3 min。加入30 μL DEPC 水溶解，檢測RNA 的濃度和純度，-80 ℃保存。

1.2.2 RT-PCR 用HiScript III RT SuperMix for qPCR 試劑盒進行反轉錄，反應體系：模板RNA 2.0 μL、4× gDNA wiper Mix 4 μL、RNase-free ddH2O 10 μL，42 ℃孵育2 min 后，向體系中加入5×HiScript III qRT SuperMix 4 μL，反應條件37 ℃ 15 min、85 ℃5 s，得到cDNA，-20 ℃保存。

1.2.3 引物設計及全基因組克隆策略 TSWV 為多分體RNA 病毒，其基因組含有3 條RNA 鏈，為進一步驗證上述結果，依據已公開的TSWV 基因組序列，設計全基因組擴增引物，L RNA 設計9 對引物，M RNA 設計5 對引物，S RNA 設計3 對引物（表1），對3 條RNA 鏈分段進行克隆，通過相鄰片段的重疊部分拼接獲得全基因組序列（圖1）。以獲得的cDNA 為模版進行PCR 擴增。PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，按照擴增片段大小進行膠回收。回收產物連接到T 載體上，連接產物轉化至大腸桿菌感受態細胞當中，篩選陽性克隆，送至上海生工生物公司測序。

1.2.4 序列分析及測定 利用DNAMAN 分別對3條RNA 進行拼接，獲得TSWV 全基因組序列。通過NCBI 中的BLAST 進行序列同源性分析，并使用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

2 結果

2.1 TSWV 樣品鑒定

對疑似TSWV 侵染樣品總RNA 進行RT-PCR擴增，并將PCR 產物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。檢測結果顯示，樣品中能夠擴增出特異性條帶，并且條帶大小與預期一致，約為274 bp，通過克隆測序和BLAST 在線比較分析，結果表明臨沂煙區疑似樣品中含有TSWV 病毒，該病毒分離物初步命名為TSWV-SDLY2。

2.2 TSWV 全基因組結構分析

RT-PCR 和克隆測序結果顯示（圖 1），TSWV-SDLY2 分離物含有3 條RNA。其中RNA L為反義鏈，全長8911 bp（GenBank:MN833242），其互補鏈能夠編碼依賴于RNA 的RNA 聚合酶RdRp，分子量大小為331.5 kDa，兩端非編碼區存在互補結構，且序列保守，形成鍋柄狀結構。RNA M 為雙義編碼RNA 鏈，全長4773 bp（GenBank:MN870629），正義編碼移動蛋白NSm（33.6 kDa），互補鏈編碼Gn（78.0 kDa）、Gc（58.0 kDa）兩種糖蛋白。RNA S也為雙義編碼RNA 鏈，全長2971 bp（GenBank:MN861978），正義編碼非結構蛋白NSs（52.4 kDa），互補鏈編碼病毒的核衣殼蛋白N（28.8 kDa）。

圖1 TSWV 全基因組克隆策略Fig.1 The cloning strategy for TSWV fragments

2.3 TSWV 全基因組序列分析及系統進化樹分析

對獲得的TSWV-SDLY2 分離物的3 條RNA 鏈進行BLAST 比對分析，利用MEGA 7.0 軟件進行系統進化分析，采用鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育樹，距離模型選擇差異位點比例（p-distance），自舉法（Bootstrap）100 次進行穩定性檢驗。分析結果顯示，TSWV-SDLY2 分離物3條RNA 鏈與已發表的TSWV 其他分離物的同源性均在99%以上。TSWV-SDLY2 分離物RNA L 與已發布的其他 9 個 TSWV 分離物（GenBank：MF805766，MF590700，MG878873，KM657122，MF422032，MF422032,MF590699，KM657120，KM657121）在同一分支上，并與其中的云南分離物（GenBank:MF805766）序列相似度最高，為99.35%，與正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）其他種：花生環斑病毒（Groundnut ringspot virus,GRSV）、鳳仙花壞死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV）、花生芽壞死病毒(Groundnut bud necrosis virus,GBNV）等聚類到不同的分支上（圖2）。RNA M 與山東分離物（GenBank:KM657118）序列相似度最高，為99.69%，RNA S 與云南分離物（GenBank:HQ402595）序列相似度最高，為99.53%，該分離物RNA M與RNA S均與其他TSWV分離物在同一分支上，與其他同屬不同種的分離物聚類到不同分支上（圖3、4）。

圖2 RNA L 系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of RNA L complete sequence

圖3 RNA M 系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of RNA M complete sequence

圖4 RNA S 系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of RNA S complete sequence

3 討 論

據我們前期實地調查，TSWV 侵染引起的煙草病毒病已經由云南煙區擴展到廣西、貴州、四川、湖南和河南等地，為害范圍呈擴大蔓延的趨勢。本研究基于前期siRNA 測序結果發現山東煙區存在TSWV 侵染的風險。為確定該結果，對山東兩個煙區臨沂和濰坊進行實地采樣調查，首次在山東臨沂平邑縣采集到疑似病樣，并通過RT-PCR 和全基因組序列測定，明確了TSWV 在山東煙區的侵染。這是首次在山東臨沂煙區發現TSWV 的侵染。將該分離物全基因組序列與其他發表的TSWV 分離物序列進行比較和遺傳進化分析，發現山東分離物與云南等地的TSWV 相似度較高，與我國的TSWV 分離物均處于同一分支上，說明山東臨沂檢出的TSWV 可能是由云南煙區帶毒介體的遷飛而傳入的。因此，有必要加強對煙區病毒病的檢疫與監控，特別是帶毒介體薊馬的精準快速檢測，控制病毒的傳播以避免造成巨大的經濟損失[14]。

TSWV 侵染導致的煙草斑萎病毒病是近年來在西南煙區為害最為嚴重的病害之一，TSWV 在侵染煙草后，可引起煙株中下部葉片產生顏色大小不同的壞死斑點或斑紋，并呈現環狀或同心輪紋狀，植株矮化萎蔫，生長發育受限等典型癥狀[15]，影響煙草的品質及產量，嚴重田塊可直接導致煙葉絕產。山東臨沂煙區感染TSWV 加劇了該病毒在全國范圍內的蔓延，有效的病毒檢測方法對TSWV 的防治至關重要。RT-PCR 檢測植物病毒是當前使用較多的一種檢測方式，具有快速、成本低、靈敏度高等優點，能夠有效檢測病毒，及時預防病毒病的大面積發生和流行[16]。在本研究中所應用的RT-PCR 檢測體系可以作為實驗室檢測該病毒的方法，但生產上依然需要更加方便快捷、特異性強的檢測體系，例如免疫膠體金層析檢測法等[17]。

TSWV 的大面積發生與其傳播介體昆蟲的大量繁殖擴散有不可分割的聯系，TSWV 的主要傳播介體西花薊馬可通過取食侵染多種寄主，這使防治TSWV 病毒的難度加大。生產上主要通過控制西花薊馬的蟲口數量來防治TSWV 病毒病[18-19]。因此，非常有必要在山東建立單頭薊馬TSWV 的快速檢測體系，為該病毒病精準預警和有效防控提供技術保障。

4 結論

結果表明，番茄斑萎病毒已在山東臨沂煙區侵染發生，這使得該病毒在山東省其他煙區的侵染風險增加，并對山東省的煙草種植生產構成新的威脅。遺傳進化分析顯示山東臨沂煙區檢出的番茄斑萎病毒可能由云南煙區傳入。因此開發更加快速靈敏的病毒檢測方法，加大煙區之間的檢疫力度，控制介體昆蟲薊馬的傳播等問題亟待解決。