酸和鹽脅迫對乳酸菌活性的影響

呂嘉櫪，伍金金，周冰洋，羅 瀟

（陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

乳酸菌能夠增強人體免疫力、修復腸粘膜損傷、抗氧化、抑菌、降血脂、降膽固醇、治療乳腺炎等[1-7]，廣泛應用于食品與發酵工業[8-10]，乳酸菌的活性是影響其產品開發與應用的重要因素。研究表明，影響乳酸菌活性的因素有很多，如溫度、pH、鹽濃度、氧濃度、營養物質等[11-14]。

發酵食品的顯著特征是高含鹽量，且隨著發酵的進行積累大量的酸，所以研究酸和鹽脅迫對乳酸菌活性的影響十分重要。王璐[15]對嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）進行耐鹽實驗，發現鹽脅迫對這兩株乳酸菌的生長有很大的抑制作用，接著不斷地將乳酸菌轉接到更高鹽濃度的培養基中馴化培養，發現馴化后的乳酸菌能夠提高對鹽脅迫的耐受性；南曉芳等[16]從豆豉和腐乳中分離并篩選出了5株耐鹽性高達12%的乳酸菌，乳酸菌的耐鹽特性對于提高豆豉和腐乳的品質有著重要的作用；崔樹茂[17]研究了不同濃度的氯化鈉、乳酸鈉和乙酸鈉對乳酸菌生長的影響，結果表明這3種胞外酸根對乳酸菌完全抑制時的濃度相同；施為家[18]研究發現，pH值對乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）營養物質的吸收、胞內酶的活性和有氧呼吸效率等許多細胞生理功能都有十分重要的影響；閆征等[19]分別用乳酸和HCl調節培養初始pH值，研究了不同pH條件下乳酸產量和乳酸菌的生長情況，結果表明，乳酸的逐漸積累是導致乳酸菌的生長和乳酸產量受到抑制的直接原因，而H+濃度的增加（pH降低）則是間接原因；尚天翠[20]和熊素玉等[21]分別從乳制品中分離純化出10株和24株乳酸菌，研究發現這兩次分離純化的乳酸菌最適pH值都在6.5左右。目前對于酸和鹽脅迫條件下乳酸菌活性的影響已有一些報道，但同時研究酸脅迫和鹽脅迫對乳酸菌活性的影響報道較少，且大多數研究選取的乳酸菌菌種不夠全面，不能進行橫向比較。

本研究廣泛選取13株食品中常見的乳酸菌，在不同的鹽濃度和pH值條件下培養，測定其在不同鹽和酸條件下的生長曲線，期望獲得每株菌最適的酸和鹽生長條件，并進行橫向比較，并探索這13株乳酸菌的耐酸、耐鹽能力，為乳酸菌更好地應用于食品行業提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試乳酸菌

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）（Lb）、嗜酸乳桿菌（Lactibacillus acidophilus）（La）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）（Lc）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（Lp）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）（Lr）、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）（Bl）、動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）（Ba）、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）（Bi）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）（Lcp）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）（Pi）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（Pp）、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.）（Ll）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（St）：均由陜西科技大學食品與生物工程學院提供。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基[22]：蛋白胨10 g，牛肉膏8 g，酵母膏4 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二氨2 g，吐溫-80 1 mL，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.04 g，MnSO4·7H2O 0.2 g，水1 000 mL。pH值自然，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：北京奧博星生物技術責任有限公司；葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二氨、吐溫-80、K2HPO4、MnSO4·4H2O、MnSO4·7H2O、甲苯胺藍、氫氧化鈉、濃鹽酸、醋酸、氯化鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司；DHP-9080電熱恒溫培養箱：上海佳勝試驗設備有限公司；101-1電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌種的活化

將MRS液體培養基加入厭氧管中，從固體斜面培養基將供試乳酸菌接種到MRS液體培養基中，37 ℃活化培養48 h，甲苯胺藍染色[23]，鏡檢，無雜菌后二次活化，4 ℃冰箱保存備用[24]。

1.3.2 乳酸菌生長曲線的測定

將活化好的乳酸菌分別以1%（V/V）的接種量接種到MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養72 h，分別在培養0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取樣，以未接種的MRS液體調節零點，在波長為600 nm處測定樣品的OD600nm值。以OD600nm值為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制乳酸菌的生長曲線。

1.3.3 鹽脅迫對乳酸菌生長的影響

MRS液體培養基中分別添加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的NaCl，將活化好的乳酸菌分別以1%（V/V）的接種量接種到不同鹽濃度的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養72 h，分別在培養0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h時取樣，以未接種的MRS液體調節零點，在波長600 nm處測定樣品的OD600nm值，繪制乳酸菌的生長曲線。

1.3.4 酸脅迫對乳酸菌生長的影響

用1 mol/L HCl溶液將MRS液體培養基的pH值分別調為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，再用1 mol/L NaOH溶液將MRS液體培養基的pH值調為7.0。取活化好的乳酸菌分別以1%（V/V）的接種量接種于不同pH值的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養168 h，分別在培養0 h、4 h、8 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h時取樣，以未接種的MRS液體調節零點，在波長600 nm處測定樣品的OD600nm值，繪制乳酸菌的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

圖1 13株乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria

由圖1可知，13株乳酸菌在MRS液體培養基中生長良好，其中乳酸菌Pi和Pp遲緩期為4 h，乳酸菌Lp、Lc、Lcp遲緩期為8 h，乳酸菌Lr、Ll和St遲緩期為12 h，乳酸菌Lb、La、Bl、Bi和Ba遲緩期為20 h，進入對數期后，13株乳酸菌的活菌數均直線上升，36 h后所有乳酸菌到達穩定期，并且在穩定期，OD600nm值一直保持較高水平，72 h內沒有進入衰亡期。到達穩定期時乳酸菌Lb和La的OD600nm值低于另外11株菌，說明自然狀態下乳酸菌Lb和La活性低于其他11株菌。

2.2 鹽脅迫對13株乳酸菌生長的影響

圖2 1%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 1%

由圖2可知，鹽濃度為1%時，乳酸菌Lp和Lcp的遲緩期為4 h，乳酸菌Lc、Pp和Pi的遲緩期為8 h，乳酸菌Lb、Ll、St、La和Lr的遲緩期為12 h，乳酸菌Bi、Bl和Ba的遲緩期為20 h，乳酸菌Lp、Lcp、Lb、La的遲緩期比不加鹽時的短，且到達穩定期時乳酸菌Lp、Lcp、Lb、La的OD600nm值高于不加鹽時穩定期的OD600nm值，表明鹽濃度為1%時有利于乳酸菌Lp、Lcp、Lb、La的生長。

圖3 2%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 2%

由圖3可知，鹽濃度為2%時，乳酸菌Lcp和Lp的遲緩期為4 h，乳酸菌Lr、Pi、Pp和Lc的遲緩期為8 h，乳酸菌St和Ll遲緩期為12 h，乳酸菌Ba和La的遲緩期為16 h，乳酸菌Bl和Lb的遲緩期為20 h，乳酸菌Bi的遲緩期為24 h，說明鹽濃度為2%有利于縮短乳酸菌Lp、Lcp、Lr、La、Ba的生長遲緩期，促進這5株菌的前期生長；到達穩定期時乳酸菌Lc的OD600nm值低于其他12株菌，說明鹽濃度為2%時乳酸菌Lc對鹽脅迫更敏感；乳酸菌Lb及La的穩定期OD600nm值同樣高于不加鹽時的穩定期OD600nm值，且高于鹽濃度為1%時的穩定期OD600nm值，說明鹽濃度為2%進一步促進了乳酸菌Lb、La的生長。

圖4 3%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.4 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 3%

由圖4可知，鹽濃度為3%時增加了乳酸菌Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Ba、Lb的生長遲緩期，抑制了這8株菌的前期生長；到達穩定期時除了乳酸菌Lb和La，其余11株乳酸菌的生長都受到了抑制，且乳酸菌Lc和Pi的穩定期OD600nm值低于其他11株菌，說明鹽濃度為3%時乳酸菌Lc和Pi對鹽脅迫更敏感。

圖5 4%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.5 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 4%

由圖5可知，鹽濃度為4%時增加了乳酸菌Lb、Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Bl、Ll、St的生長遲緩期，抑制了這10株菌的前期生長；到達穩定期時除了乳酸菌Lb和La，其余11株乳酸菌的生長都受到了抑制，乳酸菌Pi和Ll的OD600nm值較其他11株菌低，且乳酸菌Pi最早進入衰亡期，說明鹽濃度為4%時乳酸菌Pi和Ll對鹽脅迫更敏感。

由圖6可知，鹽濃度為5%時增加了乳酸菌Lb、Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Bl、Ba、Ll、St的生長遲緩期，抑制了這11株菌的前期生長；到達穩定期時除了乳酸菌La，其余12株乳酸菌的OD600nm值都低于不加鹽時的OD600nm值，說明鹽濃度為5%抑制了這12株乳酸菌的生長。

由圖7可知，鹽濃度為6%時增加了乳酸菌Lb、Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Bl、Ba、Ll、St的生長遲緩期，抑制了這11株菌的前期生長；到達穩定期時除了乳酸菌La，其余12株乳酸菌的生長都受到了抑制，Lcp、Pi和Ll的OD600nm值較其他乳酸菌低，說明鹽濃度為6%時乳酸菌Lcp、Pi和Ll對鹽脅迫更敏感。

圖6 5%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.6 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 5%

圖7 6%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.7 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 6%

圖8 7%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.8 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 7%

由圖8可知，除了乳酸菌Lcp，其余12株菌的遲緩期都顯著增加，鹽濃度為7%抑制了這12株菌的前期生長；到達穩定期時13株乳酸菌的OD600nm值都低于不加鹽時的OD600nm值，說明鹽濃度為7%抑制了這13株乳酸菌的生長。

由圖9可知，鹽濃度為8%對這13株乳酸菌的整個生長過程都有抑制作用，且對乳酸菌Lcp、Lp、Pi、Pp、Lr、Ll、St的生長抑制率＞50%，對乳酸菌La、Bi、Bl、Ba、Lb、Lc的生長抑制率＞95%。

由圖10可知，鹽濃度為9%對這13株乳酸菌的生長有顯著抑制作用，且對乳酸菌Lcp、Pi、St、Pp、Ll的生長抑制率＞70%，對其余8株乳酸菌的生長抑制率＞95%。

圖9 8%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.9 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 8%

圖10 9%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.10 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 9%

圖11 10%鹽濃度時13株乳酸菌的生長曲線Fig.11 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 10%

由圖11可知，鹽濃度為10%時，乳酸菌Lcp在第8小時開始緩慢生長，在第36小時時進入穩定期，最終穩定期OD600nm值為0.165，中間沒有出現明顯的對數生長期，OD600nm值維持在0.1左右；乳酸菌Pi、Pp、St及Ll在48 h后開始生長，72 h后進入穩定期，最大OD600nm值為1.053；其余8株菌直至測定結束OD600nm值沒有顯著變化，接近于零。說明鹽濃度為10%對這13株乳酸菌的生長有顯著抑制作用，且除了乳酸菌Pi、Pp、St、Ll，其余9株乳酸菌的生長抑制率都＞95%，高鹽濃度對9株桿菌的抑制作用強于4株球菌。

2.3 酸脅迫對13株乳酸菌生長的影響

圖12 pH=1時13株乳酸菌的生長曲線Fig.12 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=1

圖13 pH=2時13株乳酸菌的生長曲線Fig.13 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=2

圖14 pH=3時13株乳酸菌的生長曲線Fig.14 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=3

由圖12～14可知，pH=1～3時，13株乳酸菌都不能明顯的生長，OD600nm值一直維持在較低水平，最大不超過0.3，其中4株球菌的OD600nm值高于9株桿菌，說明高酸條件對9株桿菌的抑制作用強于4株球菌；12～24 h是9株桿菌的對數生長期，24 h后OD600nm值基本維持在0.1左右。原因是培養基中所加乳酸的量過多，抑制了乳酸菌本身發酵產乳酸的過程，另一方面，pH值過低本身就不利于乳酸菌繼續生長。

由圖15可知，pH=4時，長勢較好的前3株菌依次是乳酸菌Lcp、Lr、Pi，其中，乳酸菌Lcp的遲緩期為12 h，最終穩定期OD600nm值為2.510，乳酸菌Lr在第48小時進入對數期生長，最終穩定期OD600nm值為2.256，乳酸菌Pi也在第48小時進入對數生長期，最終穩定期OD600nm值為1.983，這3株菌直到測定結束的168 h內并未出現衰亡期，說明這3株乳酸菌在酸脅迫開始解除時最先生長。乳酸菌Lb和La在96 h后顯著生長，最大OD600nm值為1.192，說明pH=4對乳酸菌Lb和La的前期生長仍有抑制作用，直到適應pH條件后活菌數開始上升，但仍未達到自然條件下的活菌數。其余8株菌遲緩期為24 h，此后緩慢生長，在144 h后都進入了穩定期，且最終穩定期OD600nm值都比較低，說明pH=4對這8株乳酸菌的生長仍有抑制作用。

圖15 pH=4時13株乳酸菌的生長曲線Fig.15 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=4

圖16 pH=5時13株乳酸菌的生長曲線Fig.16 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=5

由圖16可知，pH=5時，乳酸菌Pi和Pp的遲緩期為8 h，乳酸菌Lc、Lp、Lcp和Lr的遲緩期為12 h，乳酸菌La的遲緩期為36 h，其余6株菌的遲緩期為24 h，13株乳酸菌在48 h后都進入了穩定期，且穩定期OD600nm值都維持在較高水平，說明13株乳酸菌在測定結束時都長勢良好。

由圖17可知，pH=6時，乳酸菌Lcp、Pi和Pp的遲緩期為4 h，其余10株菌的遲緩期分別在8 h、12 h和24 h，之后進入對數期，OD600nm值顯著增大，在36 h后都進入了穩定期且穩定期OD600nm值都維持在較高水平，說明pH=6時13株乳酸菌都長勢良好；乳酸菌Lb、La、Lc、Lr、Lp、Bl、Bi、Ba、Lcp、Pp、St的最終穩定期OD600nm值都高于pH=5時的最終穩定期OD600nm值，說明pH=6時這11株乳酸菌的活性高于pH=5。

圖17 pH=6時13株乳酸菌的生長曲線Fig.17 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=6

圖18 pH=7時13株乳酸菌的生長曲線Fig.18 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=7

由圖18可知，pH=7時，乳酸菌Lr、Lp、Lc及Lcp在24 h時已進入穩定期，乳酸菌Pi、St、Ll和Pp在36 h時基本進入穩定期，其余5株乳酸菌在48 h后進入穩定期，13株乳酸菌的穩定期OD600nm值都維持在較高水平，說明培養期間13株乳酸菌的長勢良好；乳酸菌Lb、La、Lc、Lr、Lcp、Pi、Li、Pp、St的最終穩定期OD600nm值都低于pH=6時的最終穩定期OD600nm值，說明pH=7時這9株乳酸菌的活性低于pH=6。

3 結論

適當的低鹽濃度（1%、2%）對部分乳酸菌的生長有促進作用，植物乳桿菌和副干酪乳桿菌的最適鹽濃度為1%，保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適鹽濃度為2%；鹽濃度進一步增大，13株乳酸菌的生長受到抑制；鹽濃度為10%時，13株乳酸菌的生長受到明顯的抑制作用，除了戊糖片球菌、乳酸片球菌、嗜熱鏈球菌及乳酸乳球菌乳酸亞種，其余9株乳酸菌的生長抑制率都＞95%。當pH值為5～7時，13株乳酸菌均生長良好；當pH=6時，7株乳酸菌活性最高；隨著酸脅迫的增強，13株乳酸菌生長受抑制程度增大；當pH值為1～3時，13株乳酸菌的生長抑制率都＞90%。隨著酸和鹽脅迫作用增強，乳酸菌生長的抑制程度逐漸增大，且高鹽、高酸條件對9株桿菌的抑制作用強于4株球菌。通過研究酸和鹽脅迫對乳酸菌活性的影響，為進一步開發利用乳酸菌資源提供一定的科學依據。