蒲公英提取物對SK-BR-3、T47D 乳腺癌細胞增殖的影響

田苗苗，劉 揚，修海楠，宋明洋，劉樹民

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040）

當今乳腺癌疾病已經(jīng)躍居女性惡性腫瘤的首位，其嚴重危害了當代女性的生命健康[1]。近年來，利用中藥活性物質(zhì)治療各類腫瘤的實驗已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點，許多中草藥及其提取物已被證實具有良好的防治乳腺癌的作用[2-3]?，F(xiàn)研究表明蒲公英活性成分主要為多糖、萜類、黃酮、植物甾醇、酚酸、內(nèi)酯、香豆素等[4-5]，其在乳腺癌治療方面體現(xiàn)出良好的苗頭[6]。蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.Mazz、堿地蒲公英的干燥全草。其味苦、甘，性寒。功效為清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋?？蓱?yīng)用于疔瘡腫毒，乳癰，瘰疬，咽痛，腸癰，熱淋澀痛[7]。本實驗主要選擇了蒲公英水煎液、蒲公英多糖、蒲公英萜醇3 種提取物進行實驗，觀察其對乳腺癌細胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 蒲公英（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院提供）；蒲公英萜醇購自于上海廣銳生物科技有限公司（批號：180402）。實驗前用DMEM 完全培養(yǎng)液溶解制成相應(yīng)濃度藥液供使用。蒲公英全草干燥后粉碎過40目篩，用石油醚連續(xù)回流6 h，殘渣按照1:20料液比，85 ℃水提2.5 h，提取2 次，Sevag 法除蛋白，藥液以85%乙醇沉淀，離心取沉淀物，無水乙醇洗滌數(shù)次，水復(fù)溶后冷凍干燥，即得蒲公英粗多糖[8-9]。按下式計算多糖得率：多糖得率＝多糖質(zhì)量/蒲公英干燥全草質(zhì)量×100%[10]，多糖得率為4.54%。蒲公英全草，按1:20 料液比，90 ℃水提2 次，每次2 h，蒲公英水煎液出粉率21.82%。人乳腺癌T47D 細胞購于中科院上海細胞庫；人乳腺癌SK-BR-3 細胞購于ATCC 細胞庫。T47D、SK-BR-3 乳腺癌細胞均用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，放置于5%CO2，37 ℃的恒溫水浴培養(yǎng)箱中，選擇狀態(tài)最佳的細胞進行細胞計數(shù)，使細胞的最終密度為5×104/mL。DMEM高糖培養(yǎng)液（批號：8118245）、胎牛血清（批號：1739463）購自美國Gibco 公司，PBS 緩沖液（批號：170919）購自北京博奧拓達科技有限公司，雙抗（批號：171019）購自上海基實有限公司，胰蛋白酶（批號：090617171012）、細胞凋亡檢測試劑盒（批號：060818181029）購自碧云天有限公司，CCK-8 檢測試劑盒（批號：LK815）購自日本同仁化學(xué)研究所。二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；倒置顯微鏡（奧林巴斯科技有限公司）；離心機（湘儀集團有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；流式細胞儀（默克密理博有限公司）；RTCA 細胞實時監(jiān)控儀（賽默飛世爾公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8 檢測細胞增殖抑制率 將密度為5×104/mL的細胞以每孔100 μL 接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，補足培養(yǎng)液，24 h 后將3 板細胞分別隨機分為7 組，即空白對照組、蒲公英水煎液25、50、100、150、200、300 mg/mL 組；空白對照組、蒲公英多糖6 個濃度組，25、50、100、150、200、300 mg/mL 組；空白對照組、蒲公英萜醇6 個濃度組，25、50、100、150、200、300 μmol/L，每組5 個復(fù)孔。加藥結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將各組細胞改用終濃度含10% CCK-8 的培養(yǎng)基進行溫育2 h，隨后在酶標儀450 nm 處讀取吸光度（OD）值。

1.2.2 實時xCELLigence 細胞分析系統(tǒng)監(jiān)測細胞增殖毒性 基線檢測所有孔Cell Index 低于0.063，將密度為5×104/mL 的T47D、SK-BR-3 細胞懸液以每孔100 μL接種于E-Plate 16 板中，室溫放置30 min。開始Step2（24 h檢測細胞增殖曲線），24 h 后給予藥物，藥物濃度，同2.1，開始Step3，檢測48 h 內(nèi)細胞增殖毒性。

1.2.3 細胞劃痕愈合實驗 在6 孔板背后，間隔0.5 cm均勻劃5 條直線，每孔加入約1×105個T47D 乳腺癌細胞，24 h 后制造劃痕，用PBS 溶液沖洗，加入不同濃度的蒲公英萜醇同2.1 繼續(xù)培養(yǎng)。按0，24，48 h取樣，拍照測量劃痕寬度，計算各藥物濃度組細胞遷移抑制率。

1.2.4 細胞凋亡檢測 將T47D 細胞以1×105/mL 接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中，將狀態(tài)良好的細胞隨機分為7 個蒲公英萜醇終濃度組，同2.1。待加樣結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，清洗、消化、離心棄上清液，吸取100 μL Binding buffer 加入至上述各離心管中，隨后加入5 μL AnnexinV-FITC，室溫下避光溫育l0 min，向上述離心管中加入1 μLPI (100 μg/μL）染色液，避光反應(yīng)5 min，再加入400 μL 結(jié)合緩沖液，運用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0 軟件對本實驗的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 檢測細胞增殖抑制率 由表1 可知T47D乳腺癌細胞經(jīng)3 種藥物作用48 h 后，蒲公英萜醇50～300 μmol/L 組與對照組比較有顯著抑制作用（P＜0.05或P＜0.01），最高抑制率可達67.19%；蒲公英多糖100～300 mg/mL 組與對照組比較抑制作用顯著（P＜0.05 或P＜0.01），但抑制作用較蒲公英萜醇弱；蒲公英水煎液100～300 mg/mL 組與對照組比較有較顯著的抑制作用（P＜0.05），其抑制作用最弱。

表1 蒲公英提取物各藥物濃度組對T47D 細胞增殖的影響（，n =5）

表1 蒲公英提取物各藥物濃度組對T47D 細胞增殖的影響（，n =5）

注：與對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

由表2 可知SK-BR-3 乳腺癌細胞經(jīng)3 種藥物作用48 h 后，蒲公英萜醇100～300 μmol/L 組與對照組比較有顯著抑制作用（P＜0.05 或P＜0.01），其最大抑制率為43.15%；蒲公英多糖100～300 mg/mL 組與對照組比較抑制作用顯著（P＜0.05）；蒲公英水煎液100～300 mg/mL組與對照組比較有顯著抑制作用（P＜0.05 或P＜0.01），蒲公英萜醇對SK-BR-3 乳腺癌細胞增殖的抑制作用較蒲公英多糖和蒲公英水煎液強。

表2 蒲公英提取物各藥物濃度組對SK-BR-3 細胞增殖的影響（，n =5）

表2 蒲公英提取物各藥物濃度組對SK-BR-3 細胞增殖的影響（，n =5）

注：與對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.2 實時xCELLigence 細胞分析系統(tǒng)監(jiān)測細胞增殖毒性 由圖1、2、3 可知T47D 乳腺癌細胞經(jīng)藥物作用后，各藥物濃度組與對照組比較對乳腺癌細胞增殖均有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。蒲公英萜醇對T47D乳腺癌細胞增殖的抑制作用最強，72 h 時抑制率可達到70.50%。

圖1 蒲公英萜醇組T47D 細胞增殖曲線

圖2 蒲公英多糖組T47D 細胞增殖曲線

圖3 蒲公英水煎液組T47D 細胞增殖曲線

由圖4、5、6 分可知SK-BR-3 乳腺癌細胞經(jīng)藥物作用后，各藥物濃度組與對照組比較均有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性。蒲公英萜醇對SK-BR-3 乳腺癌細胞增殖的抑制作用最強，72 h 時抑制率可達45.67%。

圖4 蒲公英萜醇組SK-BR-3 細胞增殖曲線

圖5 蒲公英多糖組SK-BR-3 細胞增殖曲線

圖6 蒲公英水煎液組SK-BR-3 細胞增殖曲線

2.3 細胞劃痕愈合實驗 T47D 乳腺癌細胞劃痕經(jīng)不同濃度蒲公英萜醇作用24、48 h 后，各濃度組與對照組比較均有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性和時間劑量依賴性。蒲公英萜醇（100～300 μmol/L）作用48 h 后，T47D 乳腺癌細胞劃痕愈合顯著被抑制，最大遷移抑制率可達74.43%。見圖7。

圖7 蒲公英萜醇對T47D 乳腺癌細胞劃痕愈合的影響

2.4 細胞凋亡檢測實驗 經(jīng)蒲公英萜醇作用48 h 后，各濃度組與對照組比較T47D 細胞凋亡率均有一定程度增加，且呈劑量依賴性。蒲公英萜醇（100～300 μmol/L）組作用48 h 后誘導(dǎo)T47D 乳腺癌細胞凋亡作用顯著，見圖8。

圖8 蒲公英萜醇對T47D 乳腺癌細胞凋亡的影響

3 討論

乳腺癌是生長于乳腺腺泡上皮或者乳腺導(dǎo)管內(nèi)上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率居于當今女性腫瘤的首位[11]，雖然有關(guān)乳腺癌的臨床實驗研究已經(jīng)取得了一定的進展，但乳腺癌患者的病死率仍持逐年上升狀態(tài)[12]。PR、ER、Her-2 在乳腺癌的發(fā)病過程中起到一定作用，針對受體表達狀態(tài)，浸潤性乳腺癌大致可分為3 種分子亞型，LuminalA、B 型，三陰型和Her-2 過表達型[13-14]。不同細胞亞型的乳腺癌治療方案有所不同，ER 陽性主要采用內(nèi)分泌治療法，Lumina A 型只進行內(nèi)分泌治療，就能得到良好的治療效果[15-16]；而ER陰性，Her-2 高表達的乳腺癌可以針對Her-2 因子靶向治療[17-18]，但由于三陰性乳腺癌腫瘤惡化程度較高，采用內(nèi)分泌治療基本無效，同時缺乏有效的治療靶點[19-20]，現(xiàn)主要采用化療法治療，藥物治療效果不明顯，所以本實驗未選取三陰型乳腺癌細胞。本實驗選取蒲公英水煎液、蒲公英多糖、蒲公英萜醇分別作用于雌激素依賴Luminal 型T47D 乳腺癌細胞、Her-2 過表達型SK-BR-3 乳腺癌細胞，進行蒲公英提取物抑制乳腺癌細胞增殖作用的初篩。

3 種提取物對乳腺癌細胞的增殖均有一定抑制作用，CCK-8 增殖檢測實驗和細胞增殖毒性檢測結(jié)果顯示單體蒲公英萜醇抑制乳腺癌細胞增殖作用更為明顯，50 μmol/L 時抑制率可達26.49%，最高抑制率可達70.50%，蒲公英多糖和水煎液組相對抑制率較低。蒲公英各種成分對乳腺癌細胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)一定的差異性，蒲公英其他成分是否具有抑制乳腺癌細胞增殖的作用，還有待進一步研究。同時實驗發(fā)現(xiàn)3 種提取物對T47D 細胞增殖的抑制作用明顯高于對SKBR-3 細胞的抑制作用。T47D 細胞屬于雌激素依賴型乳腺癌細胞，有研究表明內(nèi)分泌療法成為一種重要的治療激素依賴型乳腺癌的療法，推測蒲公英很可能通過調(diào)節(jié)T47D 乳腺癌細胞雌激素受體ER，從而達到抑制癌細胞異常增殖的作用。由于SK-BR-3 細胞中Her-2呈過表達狀態(tài)，需要針對Her-2 因子靶向治療，才能得到更好的治療效果，蒲公英提取物對其的抑制作用較對T47D 細胞的抑制作用弱。因此劃痕愈合實驗以及凋亡誘導(dǎo)實驗只選取蒲公英萜醇作為實驗研究藥物，T47D 乳腺癌細胞作為實驗研究對象，實驗結(jié)果顯示蒲公英萜醇可通過抑制T47D 乳腺癌細胞遷移并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制乳腺癌細胞增殖，但相關(guān)的凋亡通路還有待進一步實驗研究。

中藥發(fā)揮抗腫瘤作用是多環(huán)節(jié)多靶點的，且其作用的機制十分復(fù)雜[21-22]。能夠進一步明確蒲公英提取物對乳腺癌不同環(huán)節(jié)的作用機制，對今后更深入研究蒲公英對乳腺癌的治療作用有很大幫助。蒲公英不同藥用部位的提取物對乳腺癌細胞的增殖是否具有同樣的抑制作用，以及所含的不同成分對同種類型乳腺癌治療作用的平行性差異都應(yīng)進行更深入的實驗研究。蒲公英作為抗腫瘤的天然藥物，仍具有很大的藥用研究潛力，其治療乳腺癌的機制可能是今后此類實驗研究的重點。