循環腫瘤DNA在胃癌中的研究進展

丁亞杰，李朝燕，馮振，周韋利，趙愛光

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院腫瘤一科，上海 200023)

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，預后差，病死率居惡性腫瘤的第三位，5年總生存率僅10%～21%；胃癌的根治手段是手術切除，胃癌手術后40%～60%的患者出現復發轉移[1-2]。晚期胃癌的預后差，接受最佳支持治療的晚期胃癌患者總生存期僅為4.3個月[3]。因此，胃癌的早期診斷及早期治療至關重要。病理診斷為胃癌診斷的金標準，但由于胃癌的異質性以及活檢的有創性，病理診斷已不能滿足日益發展的腫瘤精準治療的需要。而作為新一代“液體活檢”技術的血漿循環腫瘤 DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)檢測，因具有微創、可重復性等優勢，在腫瘤的診斷、治療及預后檢測等方面發揮重要作用[4-6]。ctDNA可用于胃癌的早期診斷和臨床分期、療效評價和預后判斷以及轉移和復發風險的評估。腫瘤異質性與耐藥性研究在胃癌的臨床研究中起重要作用。現就ctDNA在胃癌中的研究進展予以綜述，旨在為臨床的推廣應用提供新思路。

1 ctDNA的生物學特性

循環游離DNA是一種胞外的DNA，以單鏈或雙鏈DNA、DNA蛋白質復合物等形式存在于血液、腦脊液等體液中[7]。1948年，Mandel和Meatis[8]首次發現人體血液中存在游離形式的DNA，它是由壞死或凋亡的細胞釋放的[9]。研究表明，循環游離DNA的濃度在自身免疫性疾病、心肌梗死、腫瘤、妊娠狀態中增加[10]。ctDNA是體液中循環游離DNA的一種，是僅由腫瘤細胞釋放的攜帶有腫瘤特異性遺傳學改變的自由基因組片段，ctDNA來源于腫瘤原發灶、轉移灶和循環腫瘤細胞等，釋放機制包括凋亡、壞死及分泌等，其中以凋亡釋放為主[11]。ctDNA的片段一般為170 bp，其半衰期為16 min至2.5 h[12]。ctDNA包含易位、缺失和擴增導致的基因組重排，以及表觀遺傳學的DNA變化，而DNA的變化與腫瘤的發生發展密切相關。

2 ctDNA的檢測方法

為了提高ctDNA檢測的靈敏度和特異度，腫瘤的特異性基因和腫瘤表觀遺傳學改變相關的分子標志物已經應用于ctDNA的血漿樣本檢測。腫瘤特異性的基因和表觀遺傳畸變已被用作血液樣品中ctDNA的標志。在胃癌中，低甲基化和高甲基化啟動子區被廣泛用于檢測血清中的ctDNA。染色體重排可以使用高靈敏度的重排特異性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)，但需要原發性腫瘤的全基因組測序以尋找潛在的異常靶點[13-14]。低覆蓋基因組測序檢測拷貝數變化應用于無原發腫瘤基因組信息的ctDNA檢測，這種檢測的成功需要高水平的ctDNA[15]。ctDNA中常見的標志是點突變，包括替換、插入、缺失，通常采用選擇性PCR檢測，數字PCR可檢測結構變異(如拷貝數的變化)，其與點突變具有相似的靈敏度，每個反應的特定點突變數量有限[16]。

二代測序(next generation sequencing，NGS)為ctDNA定性分析提供了可靠的手段。NGS可以對數百萬個序列各異的DNA分子同時進行測序，并將這些DNA分子片段的序列進行拼接和組裝，形成基因組信息；同時也能檢測出低頻突變，除快捷和低成本外，其對突變的檢測具有更高的靈敏度。此外，NGS還可以對基因拷貝數變化、基因重排、基因融合等改變進行分析。測序前對目標基因進行特異性PCR擴增后再測序，以提高測序的準確度，如TAm-Seq、Safe-SeqS等方法[17]。有研究者通過檢索腫瘤基因突變數據庫尋找非小細胞肺癌復發突變相關外顯子，再從腫瘤基因圖譜庫的全基因組測序結果進行篩選，又被稱為個體化深度測序(CAPP-Seq)[18]。

ctDNA檢測受到循環中存在的野生型DNA的影響，因此需要腫瘤特異性標志物和高靈敏度的方法，不同的研究方法見表1。

3 胃癌中ctDNA的研究

組織活檢仍是腫瘤診斷的金標準，但存在許多不足：①存在與侵入性取樣相關的風險，特別適用于脆弱的器官(如肺部腫瘤)，由于靈敏度不高，經常導致無法檢測早期腫瘤；②因為腫瘤的異質性和不斷變化，以組織活檢為基礎的檢查常不能準確判斷腫瘤進展情況[10-12]。ctDNA的半衰期<2 h，而蛋白質標記的半衰期血漿可以持續數周。ctDNA能在接受治療的患者中更準確地反映腫瘤的實時負荷。

表1 ctDNA的常見檢測方法

3.1ctDNA在胃癌早期診斷中的應用 胃癌的早期診斷在胃癌的治療中具有重要作用。評估特定基因的DNA甲基化是早期診斷胃癌的一種方法。甲基化導致腫瘤抑制基因的轉錄失活與胃癌的進展有關，因此檢測抑癌基因的甲基化可用于胃癌的早期診斷。Pimson等[25]檢測了202例胃癌患者血漿ctDNA中原鈣黏蛋白10和Ras相關區域家族1A基因的甲基化發現，與正常組相比，胃癌組患者血漿中這兩個基因的甲基化突變頻率增高，且這兩個基因甲基化突變的患者預后較差和復發轉移率較高，故得出原鈣黏蛋白10和Ras相關區域家族1A基因甲基化可作為胃癌血液中潛在的非侵入性診斷指標，用于胃癌的早期診斷。Balgkouranidou等[26]應用甲基化特異性PCR檢測73例可手術的胃癌患者血清中SOX17(sry like high-mobility group box 17)的甲基化水平，結果顯示在43例胃癌患者血清中檢測到SOX17啟動子甲基化，而健康人血清樣本中的SOX17啟動子均未發生甲基化；且分析發現，SOX17甲基化具有較短的總生存期。該研究提示，對抑癌基因SOX17進行甲基化水平檢測可用于胃癌的早期診斷。

3.2ctDNA在胃癌治療中的作用

3.2.1預測預后 早期發現胃癌的復發轉移，同時在靶向治療過程中及時發現個體基因的水平變化對胃癌的治療和預后至關重要。在胃癌的治療過程中，可通過檢測血漿ctDNA水平的變化，及時診斷，預測患者的預后，評價靶向藥物的療效。Hamakawa等[27]對晚期胃癌患者血漿ctDNA中的腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因進行檢測，同時監測3例患者的TP53水平與臨床預后的關系，結果發現TP53水平升高與不良預后密切相關；且手術后TP53 ctDNA的突變水平降低，而術后發生復發轉移的患者TP53的ctDNA突變水平升高。該研究通過檢測TP53基因的突變情況，分析判斷TP53基因突變水平與胃癌患者的不良預后相關，提示ctDNA可用于動態監測胃癌疾病的進展。Shoda等[28]對胃癌患者血漿ctDNA中人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)拷貝數進行檢測，研究納入60例接受手術的胃癌患者和30例健康志愿者，其中17例胃癌患者出現復發轉移；使用RPPH1(Ribonuclease P RNA component H1)作為參考基因，HER2/RPPH1定義為HER2的比值，結果顯示，術前血漿HER2比值與腫瘤組織的HER2狀態相關(P<0.001)，其靈敏度和特異度分別為0.733 和0.933；術后隨訪分析發現，在17例復發轉移病例中，4例組織樣本檢測HER2陰性，13例組織樣本檢測HER2陽性，其中7例HER2陽性患者血漿HER2比值較HER2陰性原發腫瘤患者高，提示腫瘤進展過程與HER2擴增相關，但隨著疾病的進展，血漿HER2水平呈進行性升高。該研究通過重復和無創性檢測血漿ctDNA中HER2的水平，實時評估HER2陽性患者胃癌治療的效果，提示HER2的水平與患者的預后相關，并對手術HER2陰性的初始患者在疾病復發時出現HER2狀態轉變的治療方案進行指導，克服了病理檢測不能在疾病治療中實時檢測HER2表達的問題。

3.2.2基因分型和個性化輔助治療 基因分型在精準化治療中發揮重要作用。近年來，隨著基因測序技術的發展，對胃癌分子分型的研究報道逐漸增加。癌癥基因組圖譜收集295例未放化療胃癌患者的組織和血樣，進行6種分子平臺檢測，提出4種胃癌分子分型，即EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)陽性型、微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)型、基因穩定型和染色體不穩定型[29]。另一項研究中，亞洲癌癥研究協作組發表了基于亞洲胃癌患者標本的分型，采用多項NGS技術將患者的遺傳特征進行分類，并分析了其與預后的關系；研究者根據病理標本中MSI上皮-間充質轉化和TP53的情況將胃癌分為MSI、微衛星穩定(microsatelite stability，MSS)/上皮-間充質轉化、MSS/TP53+和MSS/TP53-四種亞型，其中MSI亞型預后最好，多為腸型；MSS/TP53+型的預后較好；MSS/TP53-型預后較差，并多合并TP53突變；MSS/上皮-間充質轉化多為彌漫型，印戒細胞癌，突變率低，早期發病[30]。深入了解不同胃癌病例分子層面的內在差異，可以更精準地判斷預后，并選擇相應的治療方案，是提高胃癌療效的關鍵之一。基因分型旨在分析遺傳突變，在癌癥治療中起著重要作用，尤其在免疫治療中。目前臨床實踐中可通過從組織中獲取DNA進行基因分型，但組織活檢只能獲得局部和靜態腫瘤的信息，無法反映實時腫瘤由于異質性和不斷進化而進行的基因分型[31-32]。而ctDNA檢測則克服了這一問題，可以反映整個腫瘤的基因突變組織，且來自同一患者的ctDNA可以使用不同的階段來動態監控腫瘤進展期間發生的基因突變[33]。基于ctDNA的液體活檢可能改善腫瘤基因分型和腫瘤的靶向治療，這將更加優化胃癌的治療。Kim等[34]對61例胃癌患者進行ctDNA和組織分子分型的檢測，將患者按MSI-H和EBV的陽性情況分組，患者均采用細胞程序性死亡配體1陽性的派姆單抗進行治療，同時用有73個基因的NGS對ctDNA進行檢測，結果發現，血漿ctDNA水平升高和ctDNA正常患者的無病生存期分別為66 d和123 d，疾病控制率分別為25%和92%，客觀緩解率分別為58%和0；在ctDNA高突變負荷的患者中，MSI-H和EBV陽性患者對派姆單抗具有很高的反應率，且細胞程序性死亡配體1陽性與EBV+/MSI-H具有很高的相關性。因此，采用ctDNA液態活檢技術能夠監測靶向治療過程中的療效，為患者隨時調整用藥。Wang等[14]通過監測胃癌患者血漿ctDNA水平，指導應用曲妥珠單抗的治療，并對56例服用曲妥珠單抗患者的組織樣本和血漿HER2水平進行檢測，結果顯示在26例患者中檢測到HER2表達，而且在腫瘤組織和血漿中，HER2的擴增具有高度一致性，提示ctDNA檢測可以替代組織樣本，用以篩選HER2靶標人群；同時該研究還發現，ctDNA中HER2拷貝的變化可有效監測曲妥珠單抗的療效，曲妥珠治療有效時，血液中HER2拷貝數變化早于腫瘤標志物癌胚抗原和糖類抗原19-9，提示ctDNA可用于臨床實踐中監測患者對靶向藥物曲妥珠單抗的療效。Du等[35]基于NGS的ctDNA技術發現，胃癌患者在克唑替尼治療過程中組織和血漿的ctDNA突變有相似的突變譜；同時發現在腫瘤組織和血漿ctDNA中均有間質表皮轉化因子(mesenchymal to epithelial transition factor，MET)和重組人成纖維細胞生長因子受體2(recombinant human fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2)的擴增、抑癌基因APC和TP53拷貝數丟失以及抑癌基因APC-R216X、TP53-L111R、APC-K1444 FS等突變失活，這些基因的突變可能是患者發生腫瘤進展的機制。該研究初步通過連續監測血漿ctDNA水平，預測患者對克唑替尼的耐藥性，同時說明了克唑替尼耐藥的分子機制，并證明了ctDNA圖譜分析在治療決策和預后中的巨大潛力。

3.3克服胃癌異質性 腫瘤細胞在增殖過程中基因型可能會發生變化，即使是在同一腫瘤組織內部，不同細胞也可能存在不同的基因分型。在整個腫瘤治療過程中，伴隨著細胞增殖與藥物壓力選擇，腫瘤細胞也會出現不同的分子分型演進。腫瘤異質性存在空間和時間的二維變化的異質性。腫瘤精準診療的主要思想是基于腫瘤進化論的發現，腫瘤進化論的核心內容是腫瘤異質性，包括個體之間的腫瘤異質性和瘤體內腫瘤細胞間的異質性。因此，克服胃癌的異質性是實現精準治療的關鍵。Catenacci等[36]研究了胃癌原發腫瘤和轉移淋巴結中MET基因和FGFR2基因拷貝在空間上的異質性發現，胃癌經5-氟尿嘧啶/順鉑治療后發生腹膜轉移，且FGFR2基因擴增僅限于原發腫瘤，MET基因擴增僅限于腹膜轉移病灶。胃癌經MET單抗治療后復發轉移，血漿ctDNA中的KRAS基因拷貝數表達發生改變，可能是出現耐藥的原因；研究者通過檢測血漿ctDNA的MET、FGFR2、KRAS基因拷貝數變化，分析預測胃癌發生復發轉移的可能分子機制，用于指導MET單抗的靶向用藥。Gao等[37]采用NGS技術對30例晚期胃癌患者腫瘤相關基因的ctDNA和組織樣本進行測序，分析血漿和組織中共有的突變，包括TP53、成纖維細胞生長因子14、Smad4和磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α基因，結果發現，腫瘤組織與血漿的ctDNA基因水平差異有統計學意義；與組織切片相比，ctDNA中的突變大多數均在配對的腫瘤組織中檢測到，ctDNA具有較高濃度的HER2擴增，提示ctDNA未來可成為組織檢測的替代物。可見，基于ctDNA的技術評估可以部分地克服腫瘤異質性，并可能作為胃癌HER2分析的潛在替代物。

4 小 結

ctDNA作為一種非侵入性、方便、精確的診斷方法已越來越多地應用于臨床[38]，是一種很有前景的生物標志物，在胃癌的診斷、預后及疾病的管理和控制方面發揮著重要作用。ctDNA可以實時反映腫瘤組織的分子情況，相對于組織活檢，ctDNA更能代表整個機體的腫瘤情況[39]。然而，目前很少有研究準確地報道患者復發或死亡的敏感性和特異性，同時對ctDNA生物標記是否為復發或存活的獨立預測因子的報道也較少。此外，各個研究對ctDNA處理方法以及檢測分析方法的不同均會影響檢測結果。總之，ctDNA在胃癌的診斷、治療以及預測復發轉移方面起重要作用，有望進一步完善后廣泛應用于臨床。