白及花花青素微波提取方法的優化

王 禎，王 潔，項海萍，樊澤鵬，孫誠蔓，邢丙聰，邵清松

（1. 浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2. 浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300）

白及Bletilla striata為蘭科Orchidaceae白及屬Bletilla多年生草本植物，主產于安徽、浙江、江西、貴州等地[1]，以干燥塊莖入藥，又名甘根、白給、白芨等[2]。具有收斂止血，消腫生肌的功效，對于咯血、吐血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等有效[3]。因白及以其干燥塊莖入藥，故國內外對白及花的研究較少。白及花期為每年4?5月，花序具花3～10朵，花色為紫紅色、粉紅色[4]，具有較高的觀賞價值，還富含多種花青素等活性成分，其水提物具有較好的抗氧化能力，可作為飲品進行開發利用[5]。花青素(anthocyanidins)為水溶性天然色素，屬于多酚化合物中的類黃酮化合物，是由花色苷水解得到的有顏色的苷元[6?7]，但在自然界中很少以游離的苷元而多以糖苷的形式存在[8]。花青素不僅是植物中的主要呈色物質，還具有抗氧化[9]、降血脂[10]、抗癌[11]、抑制神經炎癥、改善血管功能[12]、平衡腸道微生物群落[13]、減緩與肝功能及結構有關的衰老惡化[14]與改善輕度至中度癡呆老年人的特定認知結果[15]等功效。花青素穩定性差，在提取純化過程中易發生降解[16]。微波法對天然色素的提取具有色素產率高、色價高、節省溶劑、節省時間等優點[17]。pH示差法和高效液相色譜法(HPLC)是定量測定花青素的常用方法，兩者具有很高的相關性[18]，其中pH示差法被農業化學家協會(AOAC)正式作為研究實驗室和食品工業中各種水果和蔬菜總花青素的基本測量方法[19?20]。本研究采用微波法進行響應面優化白及花花青素提取，并采用pH示差法測定白及總花青素，以期為白及花中花青素的綜合開發提供理論依據。

1 材料與儀器

白及花采于浙江省湖州市安吉縣上墅鄉白及基地。采摘盛花期的白及花，去除花莖部分后，于烘箱50 ℃烘干至恒量(±0.005 g)，打粉后過24目篩。于?20 ℃避光儲存，備用。氯化鉀(西隴化工股份有限公司)、無水乙酸鈉(西隴化工股份有限公司)、鹽酸(上海凌峰化學試劑有限公司)、無水甲醇(浙江漢諾化工科技有限公司)均為分析純。pH計FE20[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，AK-1000A 500克搖擺式中藥粉碎機(溫嶺市奧力中藥機械有限公司)，DHG-9031A電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，FA2204電子分析天平(上海力辰儀器科技有限公司)，NJL07-3型實驗微波爐(南京杰全微波設備有限公司)，RE-2000A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，TDL-50C低速離心機(上海安亭科學儀器廠)，Epoch2酶標儀(美國BioTek儀器有限公司)。

2 方法

2.1 總花青素的提取

取白及花粉末加入甲醇溶液(以體積分數為1%鹽酸作溶劑)進行微波萃取，離心取上清液，殘渣進行再次提取，合并2次上清液于35 ℃旋蒸1 h后用提取劑定容至10 mL，?20 ℃避光保存直至測定。

2.2 pH 示差法測定花青素條件優化

2.2.1 吸收波長的確定 因深色花色苷在可見光區的吸收波長范圍為 465～560 nm[7]，所以取花青素提取液0.2與0.6 mL的pH 1.0緩沖液混勻，于450～600 nm波長范圍內以步長5 nm進行掃描，以確定最大吸收波長。

2.2.2 平衡時間的確定 分別取花青素提取液 0.2 與 0.6 mL 的 pH 1.0 緩沖液或 pH 4.5 緩沖液混勻，室溫下避光反應0～120 min，每隔10 min測定D(530)、D(700)，以確定最佳平衡時間。

2.3 提取次數的確定

精確稱取樣品，在料液比為1∶40(料單位為g，溶液單位為mL)、體積分數為80%的甲醇溶液(以體積分數為 1% 鹽酸稀釋)、微波功率 400 W 的條件下提取 10 min，冷卻至室溫后 4 000 r·min?1離心 15 min，取上清液于35 ℃旋蒸，用提取劑定容至10 mL，為第1次提取液。將殘渣重復上述操作，為第2次提取液。共進行4次提取，按2.4分別進行總花青素質量濃度測定，以確定最佳提取次數。

2.4 總花青素質量濃度測定

參考李文峰等[21]總花青素質量濃度測定方法并略作調整。取0.2 mL花青素提取液，分別與0.6 mL的pH 1.0氯化鉀緩沖液、pH 4.5醋酸鈉緩沖液混勻。室溫下避光靜置80 min后測定D(530)、D(700)。3次重復，取平均值。總花青素(TAC)質量分數以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)的含量為標準進行計算，計算公式[22]為：TAC= {[D(530)pH1.0?D(700)pH1.0]?[D(530)pH4.5?D(700)pH4.5]}MWDF/(εL)。其中，TAC青素質量濃度(g·L?1)，D為各pH值下不同波長對應的吸光度，MW為C3G的分子量(449.2)，DF為稀釋倍數，ε為C3G的克分子吸光率常數(26 900)，L為比色皿光程(1 cm時，L=1)。再將總花青素質量濃度換算成質量分數進行對比分析。

2.5 單因素實驗

以微波功率、甲醇體積分數、提取時間和料液比為單因素，分別進行參數范圍的確定，考察不同因素對總花青素提取量的影響。精確稱取樣品，在甲醇體積分數為80%、料液比(溶質單位為g，溶劑單位 mL)1∶40、提取 20 min 的條件下，進行微波功率 (160、240、320、400、480、560、640 W，誤差為±5 W)的范圍確定；在微波功率560 W、料液比1∶40、提取20 min的條件下，確定甲醇體積分數(20%、40%、60%、80%、100%)的區間范圍；在微波功率560 W、甲醇體積分數80%、料液比1∶40的條件下，考察微波時間(2、5、10、20、30 min)的影響；在微波功率560 W、提取20 min、體積分數為80% 甲醇的條件下，進行料液比 (1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)的范圍確定。按 2.4 分別進行總花青素提取量的計算。

2.6 響應面實驗

為獲得白及花中花青素的最佳提取工藝條件，在單因素結果的基礎上，以總花青素提取量為響應值，選取微波功率(A)、甲醇體積分數(B)、微波時間(C)和料液比(D)為自變量，應用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，按照Box-Behnken中心組合設計原理，設計4因素3水平的響應面實驗。設計因素與水平如表1所示。

表 1 響應面實驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design

3 結果與分析

3.1 pH 示差法測定花青素條件優化

由圖1所示：溶液吸光度在450～530 nm區間逐漸升高，在530 nm處達最大值(0.37)，當波長繼續增加溶液吸光度逐漸下降。因此白及花中花青素在可見光譜范圍內的最大吸收波長為530 nm。

圖 1 白及花中花青素的可見光圖譜Figure 1 Visible light spectrum of anthocyanins of B. striata flowers

圖 2 白及花中花青素在緩沖液中隨時間的吸光度變化Figure 2 Change in absorbance of anthocyanins in B. striata flower over time in buffer solution

由圖2所示：D(530)隨著時間的延長而降低，50 min后吸光度變化平穩，并在80～100 min范圍內最為平穩；在pH 4.5緩沖液中，隨著時間的增加，D(530)逐漸降低，在80～90 min時，吸光度相對處于穩定狀態。因此，80 min為花青素在緩沖液中的平衡時間。

3.2 花青素的提取次數

由圖3所示：白及花中花青素隨提取次數增加而降低。第1次提取所得總花青素的提取量最大，第2次提取的提取量約為第1次的16.90%，第3、4次提取的提取量約為第1次的0.70%、0.17%。因此，為盡可能對樣品提取完全，且提高提取效率不造成溶劑浪費，選擇對樣品進行2次提取。

圖 3 白及花中花青素不同提取次數的提取量差異Figure 3 Difference in extraction amount of different extraction times of B. striata flower anthocyanin solution

3.3 單因素實驗結果

3.3.1 微波功率對總花青素提取量的影響 由圖 4所示：當微波功率為160～560 W時，總花青素的提取量隨著微波功率的增大而提高；微波功率為560 W時出現頂點，而后隨著功率增大出現了下降趨勢。這是因為在一定范圍內，隨著微波功率的增大對細胞的破壞力也逐步增強，花青素溶出物增多；但功率過高使得溫度升高，對花青素造成了一定程度的破壞，使得提取量降低。因此依據結果選擇微波功率480、560和640 W進行響應面實驗。

3.3.2 甲醇體積分數對總花青素提取量的影響 由圖5所示：當甲醇體積分數為20%～60%時，總花青素的提取量沒有明顯變化；當甲醇體積分數為60%～80%時，提取量隨著甲醇體積分數的增加而提高，在80%處達到最大值，隨后逐漸下降。說明在一定范圍內，提高甲醇體積分數有利于花青素的提取。因此依據實驗結果選擇甲醇體積分數為70%、80%和90%進行響應面實驗。

圖 4 微波功率對總花青素提取量的影響Figure 4 Effect of microwave power on the extraction amount of total anthocyanidins

圖 5 甲醇體積分數對總花青素提取量的影響Figure 5 Effect of methanol concentration on the extraction amount of total anthocyanidins

3.3.3 微波時間對總花青素提取量的影響 由圖6所示：在微波時間為2～20 min時，總花青素的提取量隨微波時間的延長而提高，在20 min時達到最大值；繼續加長提取時間，提取量則下降。這是由于在一定的微波功率下，微波時間越長，對細胞的破壞越徹底，花青素溶出物越多；但微波時間過長會使高溫對花青素破壞速度大于花青素浸出速度，花青素總提取量降低。因此依據結果選擇微波時間為10、20和30 min進行響應面實驗。

3.3.4 料液比對總花青素提取量的影響 由圖 7 所示：在料液比為 1∶10 ～ 1∶40 時，總花青素的提取量隨著溶劑量的加大逐漸提高；當料液比為1∶40時，提取量達到最大，而后緩慢下降。這是因為增加溶劑量有利于花青素的溶出，但溶劑增加比溶質增加倍數過大會稀釋提取液并浪費資源，故提取量下降。依據研究結果選擇料液比1∶30、1∶40和1∶50進行響應面實驗。

圖 6 微波時間對總花青素提取量的影響Figure 6 Effect of microwave time on the extraction amount of total anthocyanidins

圖 7 料液比對總花青素提取量的影響Figure 7 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of total anthocyanidins

3.4 響應面優化結果

3.4.1 響應面實驗設計及結果分析 在單因素實驗結果的基礎上，設計4因素3水平的響應面實驗，以總花青素提取量(Y)為響應值，微波功率(A)、甲醇體積分數(B)、微波時間(C)和料液比(D)為自變量，共進行29次實驗，其中5次為驗證實驗。將結果運用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行多元回歸擬合，得到回歸方程模型：Y=?10.774 63? 0.017 17A+0.153 27B+0.382 88C+0.175 19D+0.000 78AB+0.000 19AC+0.000 78AD?0.002 40BC+0.001 45BD+0.000 23CD?0.000 06A2?0.003 45B2?0.006 70C2?0.008 43D2。

從表2可知：模型項為極顯著，其中單項因素A、B、C、D與交叉項AB、AD及二次項C2、D2對總花青素提取量的影響達到極顯著水平(P＜0.01)，二次項A2、B2達到顯著水平(P＜0.05)，其余項因素不顯著(P＞0.05)。該模型失擬項不顯著，表明該模型建模成功。其中決定系數R2為0.95，校正系數R2Adj為0.90，表明建立的模型與實際情況擬合度較好，可用來進行分析與預測。由表2中F值可知：4個自變量在本研究實驗范圍內對提取量影響從大到小依次為A(微波功率)、D(料液比)、B(甲醇體積分數)、C(微波時間)。

表 2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) of regression model

3.4.2 響應面交互作用結果分析 由圖8可知：微波功率對提取量的影響最為顯著。微波功率與甲醇體積分數和料液比，兩兩之間交互作用較強，表現為響應面坡度較陡。隨著微波功率的增大，花青素的提取量逐漸增加。其余因素間，交互作用相對較弱，即響應面坡度較緩。根據所建立的響應面擬合方程進行參數最優分析，所得預測最佳工藝條件為：微波功率640 W，甲醇體積分數90%，微波時間22.14 min，料液比1∶48.10，在此條件下總花青素提取量為6.83 mg·g?1。結合模型預測最佳條件和實際情況，采用優化條件：微波功率640 W，甲醇體積分數90%，微波時間22 min，料液比1∶48。進行3組平行驗證試驗，其平均提取量為 (6.68 ±0.13) mg·g?1，與理論預測值 6.83 mg·g?1基本一致，表明模型與實際擬合情況較好。因此響應面法對白及花中花青素提取工藝的優化具有可行性。

圖 8 各因素交互作用對總花青素提取量影響的響應面圖Figure 8 Response surface plots showing the interactive effects of factors on total anthocyanin extraction

4 結論

本研究采用微波萃取法進行白及花中花青素的提取。在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法進行提取條件的優化，并建立了微波功率、甲醇體積分數、提取時間和料液比對總花青素提取量的二次回歸方程模型。得到最佳的提取工藝條件為：微波功率640 W，甲醇體積分數90%，微波時間22.14 min，料液比1∶48.10。結合實際情況調整參數為：微波功率640 W，甲醇體積分數90%，微波時間22 min，料液比 1∶48。在此條件下，白及花中總花青素的提取量為 (6.68±0.13) mg·g?1，與預測值 6.83 mg·g?1基本吻合。