老年非小細胞肺癌患者血漿表皮生長因子受體突變狀況的分析

姜文容，繆應新，王粟，丁立，王詩雯，趙虎，張艷梅

復旦大學附屬華東醫院檢驗科，上海200040

肺癌是目前臨床最常見的惡性腫瘤之一，其中90%以上的病理類型為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[1]。近年來，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的突變已明確與NSCLC 的靶向治療藥物——EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的療效密切相關[2]。目前，臨床EGFR 突變檢測首選組織樣本[3]，但操作侵入性大、檢測耗時，無法均化腫瘤異質性，尤其不適用于無法耐受侵入性取樣及發生獲得性耐藥后需二次活檢的老年患者。此時，循環腫瘤脫氧核糖核酸（circulating tumor deoxyribonucleic acid, ctDNA）可作為良好的替代檢測靶標。ctDNA作為液體活檢的熱門標志物之一，是存在于血漿等體液中的、來源于腫瘤細胞的雙鏈DNA 片段，且攜帶高特異的腫瘤標記，可用于患者全身腫瘤狀況變化的動態監測[4-5]。近年來，血漿ctDNA EGFR 突變的檢測已被廣泛應用于臨床NSCLC 患者EGFR-TKIs 靶向治療的療效評估，但其在老年NSCLC 患者中的突變狀況尚未見報道。本研究通過分析老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度及EGFR 突變狀況與患者性別、年齡、吸煙史、靶向藥物用藥史等臨床參數的相關性，旨在為老年患者的NSCLC 診療提供更準確的實驗室依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年6月—2020年3月，于復旦大學附屬華東醫院就診的老年NSCLC 患者84 例。納入標準：（1）年齡≥60 歲；（2）符合《中華醫學會肺癌臨床診療指南（2019 版）》[6]，且組織病理學確診為NSCLC。排除標準：（1）伴有其他器官或組織原發腫瘤；（2）近2 周內曾接受放、化療治療；（3）伴有嚴重炎癥。通過患者信息登記表及查閱電子病歷收集患者的年齡、性別、吸煙史、靶向治療史和疾病狀態等臨床資料。84 例老年NSCLC 患者年齡60～90 歲，平均（71.4±8.6）歲，其中男性42 例、女性42 例；有吸煙史23 例、無吸煙史61 例；未接受靶向治療44例、接受一、二代EGFR-TKIs 靶向治療＞1 個月40例；病情穩定32 例，腫瘤發生進展52 例。研究通過復旦大學附屬華東醫院倫理委員會審查（20160089）。

1.2 儀器與試劑NanoDrop One微量分光光度計和ABI 7500 實時熒光PCR 儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。核酸抽提試劑盒（AmoyDx離心柱型循環DNA 型核酸提取試劑）和EGFR 突變檢測試劑盒（AmoyDxEGFR 基因T790M 突變檢測試劑）購自廈門艾德生物醫藥有限公司。

1.3 檢測方法 使用EDTA-K2采血管，采集研究對象空腹外周靜脈血10 mL。每例樣本2 000 g 離心10 min分離所有血漿；8 000 g 再次離心10 min 后，分離4 mL血漿，采用AmoyDx循環DNA 型核酸提取試劑（離心柱型）進行ctDNA 抽提。采用NanoDrop One 微量分光光度計檢測抽提樣本的ctDNA 濃度后，采用AmoyDxEGFR基因突變檢測試劑進行EGFR突變的檢測。完成反應混合液的配置及樣本和對照品的加樣后，使用ABI 7500 實時熒光PCR 儀進行檢測。在對照品和各樣本內控VIC 信號均判定合格的情況下，通過計算Ct 值（Ct 值= Ct 值FAM/ROX/CY5-Ct 值VIC）進行結果判定，若Ct 值小于某型別判定下限則為該型別突變型，反之則為野生型。共可檢出7 類主要EGFR 突變類型，即：19del、L858R、T790M、20ins、G719X、L861Q 和S768I。

1.4 統計學方法 所有統計分析使用SPSS 22.0 統計軟件。患者年齡為正態分布計量資料，以均數±標準差（±s）表示；ctDNA 濃度為偏態分布計量資料，以中位數（四分位間距）表示，采用秩和檢驗；EGFR 突變率及突變類型為計數資料，以例數表示，采用檢驗，＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿ctDNA 濃度及EGFR 突變率與老年NSCLC患者臨床參數的相關性 84 例老年NSCLC 患者的血漿ctDNA 濃度為7.70（4.85,10.90）ng/L。不同年齡組的老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度差異有統計學意義（=0.043），75～90 歲組患者血漿ctDNA 濃度較60～74 歲組更高。不同疾病狀態組的血漿ctDNA 濃度也存在統計學差異（=0.008），腫瘤進展組患者的ctDNA 濃度高于病情穩定組。

表1 老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度及EGFR 突變率與臨床各參數的相關性

46 例患者為EGFR 突變型，EGFR 突變率為54.76%。老年NSCLC 患者血漿ctDNA 的EGFR 突變率與靶向治療相關，未接受靶向治療組患者的突變率低于靶向治療組，差異有統計學意義（=0.002）。其余各臨床參數分組的血漿ctDNA EGFR突變率均無統計學差異（＞0.05）。見表1。

2.2 血漿ctDNA EGFR 突變與老年NSCLC 患者臨床參數的相關性84 例老年NSCLC患者中，攜帶EGFRTKIs 敏感突變的有35 例，敏感突變率為41.67%；攜帶耐藥突變的有11 例，耐藥突變率為13.10%。75～90歲、無吸煙史的女性NSCLC 患者攜帶敏感突變的比例更高；而60～74 歲、有吸煙史的男性NSCLC 患者攜帶耐藥突變的比例更高。

在46 例突變型病例中，19 例檢出19del、14 例檢出L858R、10 例檢出T790M、3 例檢出其他EGFR突變型別。進一步分析發現，老年NSCLC 患者血漿ctDNA 的EGFR 突變與吸煙史（=0.046）、靶向治療史（=0.023）和疾病狀態（=0.016）均相關。接受靶向藥物治療組及疾病進展組患者的T790M 檢出率高于未接受靶向治療組及疾病穩定組。見表2。

3 討論

目前，肺癌的發病率和病死率呈逐年上升趨勢。由于其發病隱匿，缺乏有效的早期檢測手段，約80%患者確診時已屬中晚期，并可伴有遠端轉移，致使其預后較差、生存率較低，已成為我國老年腫瘤患者主要的死亡原因[7]。

EGFR 是一種跨膜糖蛋白，屬于受體型酪氨酸激酶，其活性與腫瘤的生長、侵襲和轉移密切相關[8]。EGFR 的突變與EGFR-TKIs 的療效密切相關。在亞裔NSCLC 患者中，EGFR 的突變率高達50%[9]，其中19 號外顯子的缺失突變以及21 號外顯子的L858R突變約占EGFR 突變總數的90%，與患者對EGFR-TKIs治療的敏感性顯著關聯[10]。EGFR 20 號外顯子的錯義突變T790M 是最主要的EGFR-TKIs 治療后獲得性耐藥突變[11]。通常接受一、二代EGFR-TKIs 治療的患者會在治療后的9～13 個月出現耐藥，其中約50%的患者是由于T790M 突變所致[12]。

目前，組織活檢是EGFR 檢測的金標準，但其侵入性大、無法實時監測、且檢測結果受樣本采集影響大。而血漿ctDNA 的EGFR 突變檢測僅需采集患者血液樣本，創傷小；可實現多次重復采樣，實時跟蹤疾病的進展，尤其是發現繼發性耐藥；還能夠克服腫瘤組織異質性的影響，尤其適用于無法通過再次手術或活檢獲取腫瘤組織的患者，已被廣泛應用于臨床腫瘤患者的輔助診斷[13-14]。ctDNA 的基因特性與原位腫瘤組織高度一致[15]，監測ctDNA 的EGFR 突變負荷變化能夠在影像學變化前對患者進行療效評估[16]，故血漿ctDNA EGFR 突變狀況的連續監測在NSCLC 患者接受EGFR-TKIs 靶向治療療效評估方面具有重要的臨床應用價值。當然，血液中的ctDNA 含量極少，因而對其檢測方法的靈敏度要求也更高。

本研究發現，不同年齡組和不同疾病狀態組的老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度存在統計學差異。高年齡組的ctDNA 濃度高于低年齡組，其可能的原因為高年齡組患者體內的腫瘤負荷隨著病程延長而逐步增加，導致ctDNA 釋放增多。進展組的ctDNA 濃度高于穩定組，則可能是由于ctDNA 濃度與腫瘤的活動性相關，在腫瘤進展期ctDNA 的釋放可增加[17]。通過對血漿ctDNA 的EGFR 突變檢測發現，老年NSCLC 患者的EGFR 突變率為54.76%，略高于亞裔人群的普遍突變率（約50%）[9]，說明基于血漿ctDNA的EGFR 突變檢測同樣能為臨床EGFR-TKIs 的使用提供參考依據。同時，研究結果顯示老年NSCLC 患者的EGFR 突變率與其靶向治療史有關，接受靶向治療組患者的EGFR 突變率高于未接受靶向治療組。考慮其可能的原因為：（1）未接受靶向治療的患者通常是由于基礎疾病等原因無法進行組織樣本檢測的群體，其EGFR 突變狀況未知，突變率符合人群一般水平；（2）而接受靶向治療的患者通常以確認EGFR 突變狀況的改變和是否需要更換治療手段為檢測目的，多數已通過先期檢測確定攜帶有EGFR-TKIs 敏感突變，在進行靶向治療后、疾病發生進展時進行復檢以確認是否出現獲得性耐藥突變，通常至少攜帶1 種突變，甚至可檢出雙重突變；（3）此外，化療可導致EGFR 突變狀況的改變[18]，故聯合使用化療的患者也需定期復檢以保證靶向療效。進一步對EGFR 突變狀況進行分析發現，接受靶向治療組和疾病進展組的T790M 檢出率高于未接受靶向治療組和疾病穩定組，與以往的研究結果一致[19]，也再次證實了T790M 為EGFRTKIs 最重要的獲得性耐藥突變位點，以及在靶向治療過程中監測EGFR 突變的重要性。本次研究還發現老年NSCLC 患者血漿ctDNA EGFR 突變類型與吸煙史有關，與既往報道不一致[20]，其原因可能與入組患者數量和檢測方法等因素有關。

表2 老年NSCLC 患者血漿ctDNA EGFR 突變與臨床各參數的相關性

本研究綜合分析了老年NSCLC 患者血漿ctDNA EGFR 突變狀況與各臨床參數間的相關性，發現不同年齡、疾病狀態的老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度存在差異；老年NSCLC 患者血漿ctDNA EGFR 突變率相對較高，并與靶向治療史相關，且EGFR 突變狀況也因靶向治療史和疾病狀態的不同而存在差異，證實了血漿ctDNA EGFR 突變檢測在臨床EGFR-TKIs治療和療效評估中的重要性。本研究也存在一定局限性，如病例數有限、未對患者進行靶向治療前后的跟蹤分析，尚無法全面評估血漿ctDNA EGFR 突變檢測在動態監測中的應用，有待在未來工作中進一步完善。綜上所述，血漿ctDNA EGFR 突變檢測具有實時、無創和均質等優勢，在臨床實際診療中，應盡量獲取患者全身腫瘤狀況的動態變化，并結合具體臨床參數，為臨床老年NSCLC 患者提供更精準的診療服務。