低產乙醛拉格啤酒酵母的選育

孫傳伯，曹 猛，陳存武，趙 群

(1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237000；2.海南大學 化學工程與技術學院，海南 海口 570228)

拉格啤酒(Lager Beer，名字來源于德語：Lagern，意為窖藏)，又稱窖藏啤酒，是一種利用低溫熟成技術制作的啤酒。采用桶底發酵的酵母菌發酵而成。在現在的市場上，啤酒的品牌多，市場需求量大，各種品牌都有其特色作為賣點，然而很多啤酒在其風味物質控制方面做得不夠。不管是哪一種啤酒，因其原料所含有的營養物質很豐富，在發酵過程中被微生物分解，生成很多產物，其中有多種風味物質，比如醛類、高級醇、高級酯等，它們對啤酒的風味影響差別也很大，尤其是乙醛造成的影響較大。除此外，根據一些研究報道指出乙醛對人體有一定的危害，產生不良反應，包括使人產生惡心、嘔吐等[1]。如果我們能夠將啤酒中乙醛的含量控制下來，對其的風味和其對人健康的影響的變化都是很大的。從目前發表的文章等可以發現，通過改進生產工藝的方法來降低產生的乙醛含量的方法很多[2]，也有人利用分子生物學的技術處理菌株[3]，此外，還有利用超高壓進行誘變的方法等[4-5]。本實驗是在紫外誘變技術的基礎上，通過一系列篩選方法確定一種篩選產乙醛低的酵母的方法，以便用于拉格的工業化生產中，做到以此方法篩選的菌株進行發酵生產獲得高品質拉格啤酒，同時，產生較大的經濟方面的效益。

1 材料和方法

1.1 儀器設備

見表1。

1.2 材料和試劑

見表2。

1.3 實驗方法

1.3.1 麥芽汁培養基的制備

用粉碎機將麥芽粉碎，稱取粉碎物，以1∶4(麥芽:水)的比例加入足量的水，在65 ℃水浴鍋中加熱2 h，取出進行首次過濾后，對濾液煮沸15 min后，進行再次過濾，用糖度計測其糖度，并加水調整糖度值為10后，進行滅菌(121 ℃，20 min)，對滅菌后的培養基進行再一次的過濾滅菌。

表1 實驗中使用儀器設備

表2 實驗材料與試劑

1.3.2 酵母的活化

向200mL無菌水中加入無菌條件下取的斜面試管酵母(編號L33)，置于搖床上進行活化處理。吸取少量活化后的酵母懸液進行平板涂布，放于培養箱中培養(28 ℃，48～72 h)。選擇培養后長勢較好的單菌落作為出發菌株1，進行斜面保藏。

1.3.3 篩選方法

方法一(希夫組)：在麥芽汁平板上涂布出發菌株1，紫外誘變后，經新配制的希夫試劑篩選后進行高效液相色譜分析；

方法二(甲吡唑組)：在添加有甲吡唑的麥芽汁培養基上涂布出發菌株1，紫外誘變后，經新配制的希夫試劑篩選后進行高效液相色譜分析；

方法三(乙醛組)：在麥芽汁培養基上涂布出發菌株1，紫外誘變后，先經希夫試劑篩選后，再在添加有乙醛的培養基上進行涂布篩選，最后再通過高效液相色譜進行分析。

1.3.4 紫外誘變條件的優化

超凈工作臺的紫外燈的功率為20 W，實驗中以菌株與紫外燈的距離以及菌株被紫外燈照射的時間為變量。其中距離分別為18 cm、24 cm、30 cm，照射時間分別為0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s，共21組，每組三個平行[6]。把涂布有酵母菌的麥芽汁培養基平板置于上述條件下進行紫外誘變處理。選出后續實驗關于紫外誘變處理的最優條件。

1.3.5 希夫試劑的配方優化

方法一：詳細方法詳見參考文獻[7]，文獻方法中的蒸餾水替換為去離子水。

方法二：詳細方法詳見參考文獻[8]。

1.3.6 甲吡唑培養基濃度的優化

配制甲吡唑溶液并密封保存于4 ℃條件下。將1 g/L濃度的甲吡唑溶液用無菌注射器在0.2 μm無菌膜下過濾。分別吸取一定量配制成甲吡唑濃度為0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、650 mg/L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/L、850 mg/L、900 mg/L，每組平板做三個平行。確定后續實驗中甲吡唑培養基中甲吡唑的最佳濃度[8]。

1.3.7 乙醛培養基濃度的優化

從經過紫外誘變后篩選得到的酵母菌種中選擇任意的一種，用于做乙醛培養基中乙醛濃度的優化。取適量經過稀釋后的乙醛加入培養基中，從而使得乙醛的終濃度分別為0 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L、3 mg/L、3.5 mg/L、4 mg/L、4.5 mg/L、5 mg/L。每組做三個平行平板，根據平板上酵母菌的存活率來確定出乙醛培養基中乙醛的最佳濃度[9]。

1.3.8 三角瓶發酵實驗

對所有篩選出的斜面保藏的菌株進行三角瓶發酵實驗：從裝有100 mL無菌水的三角瓶中取少量水加入到試管斜面，用接種環將斜面上的菌刮下來后，然后將其加入到前面裝有無菌水的三角瓶中，然后進行適度稀釋，再向裝有100 mL麥芽汁的三角瓶中分別加入1 mL菌液(107個/ML)，每支試管樣至少做3～5個三角瓶，放于培養箱中培養。

1.3.9 液相色譜條件的優化

流動相中乙腈與水體積比為3∶1，柱溫為30 ℃，檢測器為二極管陣列檢測器，將其分析運行時間分別設置為5 min、10 min，流速分別設置為0.1 mL/min、0.2 mL/min、1.0 mL/min，進樣量為10.0 μL，檢測波長360 nm[10]，在此基礎上進行液相條件的優化[11]。

精確取2,4-二硝基苯肼0.0500 g，用乙腈進行定容配制成濃度為50 mg/L的溶液，并經過孔徑0.45 μm的有機系微孔濾膜過濾處理。同時將接種酵母后的得到的發酵液經過孔徑為0.45 μm的水系微孔濾膜過濾處理。按照體積比分別為1∶1、1∶2、1∶5、2∶1、5∶1取發酵液與2,4-二硝基苯肼溶液進行混合，靜止30 min后進行測定[12]。

1.3.10 液相色譜測發酵液中的乙醛含量

因為乙醛與2,4-二硝基苯肼兩種物質混合后會反應產生乙醛-2,4-二硝基苯腙，利用液相色譜，通過外標法測定反應產物的含量再通過反應關系換算求得乙醛含量。稱取0.0052 g乙醛-2,4-二硝基苯腙的標準品，并用乙腈定容至50 mL，分別從中取0 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL定容至50 mL，配制成標準待測溶液，按照液相色譜的優化條件進行標準曲線的測定。以配制的標準品乙醛-2,4-二硝基苯腙的濃度為橫坐標，以色譜圖中的峰面積為縱坐標，制作關于標準品的標準曲線，以便后續定量分析的需要[13-16]。

發酵液乙醛含量測定：取前面提到的經過處理的發酵液用于液相色譜測定。根據標準曲線方程，由峰面積計算出樣品中反應產物乙醛-2,4-二硝基苯腙的濃度，從而計算出發酵液中乙醛含量。根據所有發酵液測出來的值，經過換算后得出各菌株發酵液中乙醛含量。對各組發酵液進行乙醛降幅和平均降幅的計算[9]。

1.3.11 方法穩定性實驗

重新選取一株酵母菌作為出發菌株2(編號L37)，通過前面選出的最優方法對其進行處理后篩選的菌株作為原代，同時進行傳代實驗，連續培養至第5代，對每代菌都進行發酵實驗，按照同樣的液相色譜條件進行測量分析[17]，驗證篩選方法的穩定性。對出發菌株2及經過篩選方法后得到的出發菌株2原代進行鏡鑒比較，觀察其的形態差別。

2 結果與分析

2.1 紫外誘變最優條件

圖1 希夫試劑配方比較(左為方法一，右為方法二)

從表3中可以看出，隨著照射時間以及光源距離的縮短，菌株的存活率逐漸降低，相對于照射距離，照射時間對酵母菌的存活率影響更大，尤其是在照射30 s～45 s的范圍，酵母的存活率大大降低，基本是由70%降到20%。當照射時間為90 s時，存活率就變得很低。考慮到實驗需要選擇一定量的菌株，所以本實驗采用菌株存活率在20%左右的篩選條件，因此紫外誘變的最優條件是45 s，24 cm。

表3 紫外誘變條件的優化結果

2.2 希夫試劑配方的優化

按照希夫試劑的兩種方法進行配制，對菌株進行篩選，發現使用方法一配制的希夫試劑染色效果較好，且不會造成菌落被沖散的現象，不同菌落顏色變化差別明顯；使用方法二配制的希夫試劑染色過淺，不同菌落染色出現的差別不明顯，同時菌落很容易就被沖散，出現呈類似于固體被溶解的現象。

2.3 甲吡唑培養基中甲吡唑濃度的優化

表4 甲吡唑濃度的優化

在實驗進行過程中，起初配制的培養基中含有的甲吡唑濃度在0～600 mg/L范圍內，但是由于菌株死亡率不高(未進行詳細的記錄)，所以將其濃度繼續增大。本實驗的思路是，將菌株涂布在含有甲吡唑的培養基不進行誘變，根據實驗結果確定菌株存活率為0時的甲吡唑濃度，再將菌株涂布在此濃度的甲吡唑培養基上并進行紫外誘變，此時平板上長出的菌即為突變后的菌株，再用希夫試劑進行進一步的篩選。而從表5中可以看到，當甲吡唑培養基中的甲吡唑濃度為900 mg/L時，酵母菌的存活率為0，所以最優的甲吡唑濃度為900 mg/L。

2.4 乙醛培養基中乙醛濃度的優化

根據實驗條件測得的酵母菌的存活率如表5。

表5 乙醛濃度的優化

由表5中的數據可以看出，隨著培養基中乙醛含量的升高，酵母菌的存活率越來越低，總的來看，存活率降低的速度比較穩定。因為此環節是在紫外誘變后并且已經被希夫試劑篩選過的菌株的基礎上進行的，而后面將菌株涂布在含有乙醛的培養基上需要有一定的存活率才能保證后續實驗的進行，所以此環節考慮采用菌株存活率為20%左右的篩選條件，由表6知，所選取的乙醛培養基中乙醛的最佳濃度為5.5 mg/L。

2.5 液相色譜測發酵液中的乙醛含量

高效液相色譜測定中，流動相中乙腈與水的體積比為3∶1，流速為1.0 mL/min，對所進樣品的分析運行時間為5 min，每次所進樣的量為10.0 μL，柱溫為30 ℃，檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長為360 nm。

將經過孔徑為0.45 μm的水系微孔濾膜過濾的發酵液，與經過孔徑為0.45 μm的有機系微孔濾膜過濾的2,4-二硝基苯肼，按照體積比為2∶1的比例加入反應管，靜置30 min后再進行測定的前處理方法相對較好。

根據前面得到的優化后的液相色譜的優化條件分析標準品，所得譜圖如下圖2：

圖2 樣品發酵液液相色譜圖

由配制的標準溶液測得的值如下表6：

表6 標準溶液的測定

由表6中數據，以標準品的濃度為橫坐標，以其峰面積為縱坐標，繪制的標準品的標準曲線的方程為：y=60.361x-1.3722，R2為0.9999，由此可以看出線性相關程度較好。

根據最優液相色譜條件測得的發酵液中乙醛濃度如表7、表8和表9所示。

表7 發酵液中乙醛濃度的測定(希夫組)

表8 發酵液中乙醛濃度的測定(甲吡唑組)

表9 發酵液中乙醛濃度的測定(乙醛組)

由表7、表8和表9中的數據計算可得，方法一的正突變菌株在所在希夫組占比為54.55%，平均降幅為17.49%，方法二的正突變菌株在所在甲吡唑組占比為25%，平均降幅為18.10%，方法三的正突變菌株在所在乙醛組占比為72.73%，平均降幅為26.12%。從突變方向來看，方法三的正突變率最高，而方法二的正突變率最低，此組內大部分都為負突變菌株且其的乙醛增幅較大。從乙醛降幅上來看，方法一的平均降幅最小，而同樣是方法三的平均降幅最大。綜合這兩點，方法三的效果最好，此法能夠在高的正突變率的前提下，獲得產乙醛低的菌株。

2.6 方法穩定性實驗

表10 方法穩定性實驗

圖3 出發菌株2(左)及原代(右)鏡檢圖

為保證穩定性實驗結果的可對比性，除了測定從出發菌株2原代到第5代的菌株發酵液外，同時測定出發菌株2的發酵液，從表10中可以發現，各代菌株產生的乙醛含量都低于原菌發酵液中的乙醛量，相對于出發菌2，出發菌株2原代至第5代產生的乙醛降幅為9.32%、8.56%、7.16%、7.92%、7.22%、6.46%，雖然隨著代數的增加產生的乙醛含量呈現出較小的增加的現象，但是乙醛降幅基本保持在7%左右，從實驗結果來看，方法三的這種篩選方法具有一定的穩定性。對出發菌株2和經方法三篩選后的原代進行鏡鑒，未見其有任何明顯的形態差異，由此也可初步認為方法三對菌株的影響表現在菌株內部或者代謝調節等其他方面。

出發菌株2及經篩選后的原代鏡檢的結果如圖3所示，出發菌株2原代的平板如圖4所示。

圖4 出發菌株2原代平板

3 結論與討論

3.1 結論與創新點

3.1.1 結論

實驗中的出發菌株1和2的發酵液中乙醛的含量均小于2.0 mg/L，達到優質啤酒的乙醛含量要求(≤8.0 mg/L)。本實驗通過三種方法進行菌株的篩選，每種方法都有一定的篩選效果。其中方法三降低菌株產乙醛的量的效果最好，出發菌株1的正突變率達到72.73%，乙醛平均降幅達到26.12%，且此方法具有一定的穩定性，可以應用于工業化生產中。

3.1.2 創新點

1)實驗中方法三將紫外誘變、希夫試劑初篩與乙醛培養基二次篩選和高效液相色譜定量測定綜合起來，對出發菌株進行多次的連續篩選，能夠進一步降低菌株產生乙醛的量，此法在目前的研究中還未見有報道。

2)本實驗中使用的出發菌株是從啤酒生產工廠獲得，是對生產菌株的優化，是進一步的改進。目前的研究中，大都是對實驗室保存的而未投入生產中的菌株的優化。實驗中的菌株，其發酵液中乙醛含量降低幅度雖然不大，但是實驗是在出發菌株的發酵液本身乙醛含量(<2.0 mg/L)就比較低的基礎上，再進一步降低其含量的，而其他研究中所用到的出發菌發酵液中的乙醛含量比較高(3.0～10.0 mg/L)。由此也能看出，實驗中方法三的篩選效果好。由產乙醛量降低這點也可以考慮適當調整企業工廠的啤酒發酵時間，在原有的基礎上進一步縮短，從而降低能源的消耗，增加企業的收益。

3.2 討論

本實驗在進行液相色譜測定前的樣品前處理時，沒有對乙醛與2,4-二硝基苯肼反應的時間進行優化。進一步的實驗可以對反應時間進行優化，找到最佳的反應時間長度。同時接下來可以對接種菌株的三角瓶的培養時間進行優化[18]，在保證啤酒品質的基礎上，進一步為企業生產增加收益。實驗中雖然從三種方法中篩選出一株產乙醛量最低的菌株并進行了斜面保存，但是由于時間的因素，沒有對其進行進一步的菌株穩定性實驗，下一步可以考慮對其進行穩定性實驗。

本實驗是利用高效液相色譜儀進行樣品的定量分析測定的方法，它相對于一般的方法具有高效靈敏的優點。然而相對氣質聯用分析來講，氣質聯用既體現了色譜法的高分離能力，又體現了質譜法的高鑒別能力，比高效液相色譜更適合乙醛含量的測定分析。本實驗起初考慮使用氣質聯用儀，但是由于儀器處于被占用狀態以及考慮到時間因素，沒能順利進行，進一步的實驗可以考慮通過氣質聯用進行分析。