大曲液化酶活力測定方法比較分析

劉璐(長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031)

0 引言

在大曲諸多理化指標檢測過程當中，液化力充分反映了大曲微生物以及酶對淀粉的降解能力，有著非常突出的以應用價值。液化淀粉酶能將淀粉分子鏈中的α-1,4 葡萄糖苷鍵隨機切斷成長短不一的短鏈糊精、少量的麥芽糖和葡萄糖，其顏色消失的速度與酶活性有關，據此可以測定液化酶活力。本文嘗試對比傳統比色法與分光光度法在大曲液化酶活力測定中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

實驗所需儀器包括滴定管、恒溫水浴鍋、自動移液器、試管、燒杯、容量瓶、三角瓶以及分光光度計。實驗所需試劑包括淀粉溶液、原碘液、稀釋碘液、糊精溶液、磷酸緩沖溶液、鹽酸溶液、以及可溶性淀粉溶液。

1.2 方法

1.2.1 比色法

首先精密稱取5.0ml 稀釋碘液將其加入50.0ml 標準容積試管內，滴加1～2 滴糊精溶液，充分混合均勻備用。精密稱取5.0g 劑量大曲粉，經磷酸緩沖液溶解，在40.0℃水浴裝置內浸取120.0min，按照15.0min 的間隔時間進行混合攪拌，確保酶液得到完全浸取，大曲自身淀粉完全消化。取上層清液置入容量瓶內，剩余殘渣混合磷酸緩沖液研磨，所得樣品轉移至標準容積100.0ml 容量瓶內，經磷酸緩沖液定容至標準刻度并充分混合均勻，經4 層紗布進行濾過處理，保留濾液備用。取25.0ml 劑量可溶性淀粉溶液(溶液濃度為20.0g/l)以及5.0ml 劑量磷酸緩沖液，加入100.0ml 標準容積試管內，在35.0℃水浴裝置內保溫10.0min，視大曲溫度情況加入相應固體曲浸出液(中溫曲的加入劑量為2.0ml，高溫曲加入劑量為20.0ml)，加入10.0ml 劑量純水，充分混合均勻后在40.0℃條件下進行保溫，定時取反應液1滴加入含稀釋碘液試管內，對顏色變化進行觀察，記錄自保溫開始至碘液顏色與標準顏色一致耗時。定義可溶性淀粉溶液用量為N，可溶性淀粉溶液濃度為n，耗時分鐘數為t1，加入固體曲浸出液體積為V，液化時間為t2，則液化力X可以用如下式(1)所示方式進行計算：

1.2.2 分光光度法

首先精密稱取10.0g 劑量大曲粉，經磷酸緩沖液溶解，前序處理方法與比色法一致。在此基礎之上精密稱取1.5g 劑量淀粉，在250.0ml 標準容積容量瓶中定容，制備濃度分別為0g/l、0.075g/l、0.15g/l、0.3g/l、0.45g/l、0.6g/l、0.9g/l 標 準 溶 液，吸 取1.0ml 劑量淀粉溶液加入裝有的5.0ml 劑量稀釋碘液以及0.5ml劑量鹽酸溶液試管內，充分混合均勻，以稀釋碘液以及鹽酸溶液為空白對照，對吸光度進行測定，并形成標準曲線。精密稱取10.0ml 劑量可溶性淀粉溶液(溶液濃度為4.0g/l)、5.0ml 劑量磷酸緩沖溶液以及10.0ml 無菌水溶液，置入150.0ml 標準容積三角瓶內，充分混合均勻后在60.0℃水浴條件條件下維持8.0min。自加入1.0ml 劑量經稀釋待測酶液開始計時，充分混合反應，維持10.0min。吸取1.0ml 劑量反應液加入含5.0ml 稀釋碘液以及0.5ml 驗算溶液試管內，充分混合均勻，在660.0nm 檢測波長條件下對吸光度進行測定。定義測定酶樣濃度為c，反應過程中加入待測定酶液量的為v，反應時間為t，則淀粉酶活力X可以用如下式(2)所示方式進行計算：

2 結果與分析

2.1 反應時間

2.1.1 比色法

除前期準備工作以外，固體曲浸出液制備耗時為120.0min，成品曲液化力會對液化時間產生直接影響。以高溫曲為例，按照式(1)計算所得液化力。

一般情況下，高溫曲液化力檢驗合格標準在0.2g/g*h～0.6g/g*h 范圍內。液化力位于底限的情況下，反應時間為150.0min，液化力位于高限的情況下，反應時間為50.0min。假定前期準備階段以及液化期間反應液制備耗時為30.0min，則合格曲液化力檢測時間在200.0～300.0min 范圍內，導致部分液化力偏低不合格曲產生，造成檢測耗時較長。

2.1.2 分光光度法

除前期準備工作以外，大曲粉浸提前準備工作耗時為15.0min，淀粉溶液配置等相關準備工作可以與酶液提取同期進行。酶液提取耗時為150.0min，預熱反應時間為8.0min，酶解反應時間為10.0min，吸光度檢測時間為5.0min，因此對淀粉酶活力的測定總耗時為158.0min。由于吸光度大小會直接決定反應底物濃度大小，因此反應時間不受成品曲液化力因素的影響，呈相對固定的狀態。

2.2 準確度

以某原料車間粉碎1#、2#高溫曲樣為實驗樣品，分別應用比色法以及分光光度法進行檢測，對檢測結果進行對比，如下表(見表1、表2)所示。結合表1，經比色法測定1#樣品液化力均值為0.43g/g*h，可作為測定真實值用于對相對誤差進行計算，經分光光度法測定1#樣品酶活力均值為0.58U/ml，可作為測定真實值用于對相對誤差進行計算。對相對誤差進行對比，1#樣品以及2#樣品比色法測定相對誤差均顯著高于分光光度法測定相對誤差，提示分光光度法對成品曲酶活力的測定準確度優于比色法。

表1 1#樣品測定結果對比

表2 2#樣品測定結果對比

3 結語

文章利用比色法以及分光光度法對大曲液化酶活力進行測定，并就反應時間以及測定結果準確度進行對比，得出以下兩個方面的結論：第一，在反應時間方面，分光光度法對大曲粉酶活力進行檢測的反應耗時為158.0min。而傳統比色法在耗時長短上直接受成品曲液化力大小的影響，合格曲液化力檢測耗時為200.0～300.0min，不合格曲液化力耗時會更長。比色法、分光光度法在檢測原理上有較高的相似性，但比色法需要等待淀粉酶將淀粉徹底酶解為藍紫色消失，而分光光度法在集中反應10.0min 的基礎之上直接應用分光光度計對試樣顏色深淺變化進行檢測，通過評估試樣顏色消失速度的方式得到相應的酶活力檢測數據，并以吸光度為依據對酶活力進行計算，因此在反應時間上較比色法更具優勢；第二，在準確度方面，比色法測定結果相對誤差顯著高于分光光度法。主要原因是比色法檢測過程中需要定時取出反應液加入裝設有稀釋碘液的試管內，并對顏色變化進行觀察，測定需要間隔時間，在試樣液化力較大的情況下顏色變化速度快，時間延遲誤差無法徹底規避，肉眼觀察也可能導致對終點顏色的判斷存在誤差。由此可見，分光光度法對大曲液化酶活力進行測定的整體效果優于比色法，可進一步推廣應用。