散結通脈方對ApoE-/-小鼠AS 斑塊逆轉和消退的作用機制研究

丁云錄，李 卓，成光宇，劉愛東

（長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021）

“散結通脈方”為全國名中醫黃永生教授臨床經驗方，臨床使用逾20 年，療效確切，臨床依據充分。本方逆轉冠狀動脈粥樣硬化斑塊有確切的療效，具有進一步開發與研究的價值和意義。本課題通過建立ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，從主動脈斑塊逆轉、消退及血清TNF-α、ox-LDL、ET-1 和IL-10 含量等方面探討痰瘀同治法穩定易損斑塊的可能機制，進一步確證中醫藥的作用靶點及治療機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 實驗動物，SPF 級8 周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，60 只，分籠飼養，室溫（23±1）℃，相對濕度50%，通風良好，室內12 h 明暗自動切換（光照時間7:00～19:00）。動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。藥品及試劑，散結通脈方浸膏，性狀：處方14 味藥，棕褐色至棕色浸膏，氣微，味苦。批號：20180329，長春中醫藥大學附屬醫院實驗研究中心提供。阿托伐他汀鈣片，規格：每片10 mg，每盒7 片，批號：20171221，國藥準字H20133127，浙江新東港藥業股份有限公司產品。戊巴比妥鈉，規格：每瓶500 mg，批號：WXBB6772V，美國Sigma 公司產品。膽固醇，規格：分析純，每瓶500 g，批號：LOT5AF10250，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品；膽酸鈉（豬），規格，分析純，每瓶500 g，批號：K01N8B47111,上海源葉生物技術有限公司產品。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒，規格：每盒96 T、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）試劑盒，規格：每盒96 T、內皮素-1（ET-1）試劑盒，規格：每盒96 T、白細胞介素-10（IL-10）試劑盒，規格：每盒96 T，批號：E20190601A，均購自美國RD 公司。儀器及器材 光學顯微鏡，型號：OlympusBX51，日本 Olympus 公司產品；圖像分析系統，型號：NIS-ELEMNT BR，日本NIKON 公司產品；石蠟切片機，型號：Leica RM2255，德國 Leica 公司產品；酶標儀，型號：BIO680，Japan BIO RAD 公司產品；臺式高速低溫離心機，型號：Biofuge Stratos，德國賀利氏公司產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 選用8 周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，60 只。小鼠予普通飼料適應性喂養1 周后，隨機分為正常對照組，模型對照組，陽性對照藥阿托伐他汀鈣49.5 mg·kg-1·d-1給藥劑量組；散結通脈方設高劑量（13.5 g·kg-1·d-1）、中劑量（6.75 g·kg-1·d-1）和低劑量（3.40 g·kg-1·d-1）3 個給藥劑量組，共6 組，每組10 只。

1.2.2 造模及給藥 建立動脈粥樣硬化斑塊模型，除正常對照組外，其余實驗組均飼以高脂飼料（2%膽固醇、0.4%膽酸鹽、10%脂肪、69.6%普通飼料）喂養12 周。實驗期間自由攝食飲水，節律光照。造模同時灌胃給予供試藥品混懸液，正常對照組及模型對照組灌胃給予蒸餾水。每3 日稱量各組小鼠體質量1 次，以調整給藥量[1-5]。

1.2.3 麻醉及取材 實驗周期結束，禁食12 h，1%戊巴比妥0.5～1.0 mL腹腔麻醉，眼眶采血，室溫靜置1 h，4℃下3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，-80 ℃凍存備用。血樣采集結束后進行剖檢，大體觀察后，分離剪取主動脈弓，放入4%多聚甲醛固定。

1.2.4 檢測指標 主動脈AS 斑塊指標。標本制作，剪取小鼠主動脈弓，4%多聚甲醛固定，經自動脫水機脫水后包埋，石蠟切片機切片，每張切片厚度為5 μm。蘇木素伊紅染色，脫蠟，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，0.5%伊紅液染色，脫水，中性樹膠封片。根據蘇木素伊紅染色結果，10 倍鏡下觀察所有斑塊，每只小鼠均選取斑塊面積最大的1 張切片測量，應用面積分析軟件，測量出斑塊面積（mm2）、血管橫截面面積（mm2）、脂質空泡面積（mm2），計算，斑塊相對面積＝斑塊面積/血管腔面積。相關細胞因子檢測：采用ELISA 試劑盒測定血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、內皮素-1（ET-1） 及白細胞介素-10（IL-10）水平。原理：夾心法酶聯免疫吸附試驗，檢測相抗體經生物素標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS 洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應經PBS 的徹底洗滌后用底物TMB 顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，并在酸的作用下最終轉化為黃色。顏色的深淺表現出樣品中相關的細胞因子水平。

1.3 統計學方法 所列數據以均數±標準差（）表示，統計學處理方法采用組間t檢驗。

2 結果

2.1 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型主動脈斑塊的影響 見表1。

2.2 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型血清TNF-α、ox-LDL、ET-1、IL-10 含量的影響 見表2。

表1 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型主動脈斑塊的影響（，n =10）

表1 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型主動脈斑塊的影響（，n =10）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型血清TNF-α、ox-LDL、ET-1、IL-10 含量的影響（，n =10）

表2 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型血清TNF-α、ox-LDL、ET-1、IL-10 含量的影響（，n =10）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3 討論

動脈粥樣硬化形成時，脂代謝紊亂，ox-LDL 含量異常升高，導致血管內皮功能受損，細胞活化，分泌TNF-α、IL-6、IL-10 等多種致炎性因子，加重血管壁的炎癥[6-8]。單核巨噬細胞分泌TNF-α，促使單核細胞攝取ox-LDL，導致泡沫細胞的形成，泡沫細胞、內皮細胞的壞死和調亡，平滑肌細胞的增殖，移行和細胞外基質增生，最終生成粥樣斑塊。另外，長期脂質代謝紊亂會刺激血管內皮細胞活性氧簇（ROS）的產生和蓄積，引起內皮細胞損傷、壞死，影響血管內皮NO 和ET-1 的分泌，血管內皮細胞生成的ET-1 具有很強的血管收縮作用，研究發現它與人類很多疾病有關，這其中就包括動脈粥樣硬化、高血壓等[9-11]。本研究發現，散結通脈方干預后，動脈粥樣硬化模型小鼠血清TNF-α、ox-LDL、ET-1 和IL-10 含量均可明顯降低，表明散結通脈方能調節介導的巨噬細胞調亡和泡沫化的進程，維持血管內皮結構和功能的完整，延遲動脈粥樣硬化炎性進程，對治療動脈粥樣硬化具有極為重要的意義。

本研究結果顯示，散結通脈方的干預與血清炎性因子水平下調和主動脈斑塊面積、脂質空泡面積及斑塊相對面積縮小相關，說明散結通脈方具有治療動脈粥樣硬化的作用。