CXCL6基因在大鼠睪丸組織發育過程中的表達*

云 霞 陳 琪 周好樂 楊 錚 塔 娜 于泊洋 張 巖 張信來 劉陶迪**

1.內蒙古醫科大學基礎醫學院（內蒙古呼和浩特010059）；2.內蒙古醫科大學附屬醫院

哺乳動物青春期后睪丸開始發育，生精細胞增殖分化，啟動生精過程。據世界衛生組織估計，10%的已婚夫婦患有不育癥,其中男性因素約占30-50%[1]。男性不育癥是人類生殖研究的重要課題。導致男性不育的原因復雜，其中精子發生過程中，由諸多基因參與的調控機制異常是重要的因素[2，3]。隨著分子生物學技術的發展與廣泛應用，揭示精子發生的分子調控機制已經成為男性不育研究領域的熱點。

CXCL6(C-X-C motif ligand 6)又名粒細胞趨化蛋白 -2(granulocyte chemotactic protein-2,GCP-2)，最初在骨肉瘤細胞株上被發現，是趨化因子的重要成員。研究表明CXCL6具有趨化粒細胞、參與炎癥反應，調節免疫應答的作用[4]。此外CXCL6促進血管生成，與腫瘤的生長和轉移有關[5]。在生殖醫學領域，雌性子宮中的研究當中發現，CXCL6與羊膜腔中的免疫反應以及抑制滋養層細胞的移行和入侵有關[6，7]。本實驗檢測CXCL6基因在2～65日齡大鼠睪丸組織中的表達,進一步探討CXCL6基因在精子發生過程中的作用。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

將購自內蒙古大學實驗動物中心，清潔級，10周齡左右的Wistar大鼠在內蒙古醫科大學動物中心飼養。將一只雄性和兩只雌性鼠合籠,自然交配,保證充足的飼料和干凈的飲水供給，每周換墊料，第8天后分籠。每日觀察雌鼠3次,將出生當天的鼠，計數為第1天，即1日齡，編號飼養。將2～65日齡，21個不同時間節點，每個時間節點3只不同窩別的，總計63只雄性Wistar大鼠頸椎脫臼法處死后，取下睪丸組織，-80℃冰箱儲存備用。

（二）實驗試劑

總RNA提取試劑盒(DP419)購自天根生化科技有限公司。反轉錄及實時定量PCR（RT-PCR），使用SYBR Prelnix Ex TaqTM試劑盒，購自大連寶生物公司。引物由上海生物工程公司合成提供。免疫組織化學染色使用UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒（鼠/兔）(福州邁新生物技術開發有限公司，Kit-9710)，用DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，Kit-0014）顯色。 兔抗大鼠 CXCL6（GCP-2）抗體（JM7139）購于北京嘉美生物技術有限公司。HRP標記的羊抗小鼠IgG購于Abcam公司。

二、實驗方法

（一）總RNA提取

取各時間節點的50mg睪丸組織，按照總RNA提取試劑盒說明書操作步驟，提取總RNA。用紫外分光光度儀測定RNA濃度和純度。RNA濃度測定3次，取平均值。RNA純度以A260/A280比值在1.95～2.10之間為合格。總RNA提取物管-80℃冰箱保存。

（二）RNA反轉錄為cDNA

根據各樣品總RNA的濃度和純度值，將樣品制成體積 30μl，濃度為 0.2μg／μl的稀釋液，制作轉錄體系A液和B液。A液10μl，包括樣本總RNA 4.0μl，Oligo-dt(10umol/L)1.0μl，加入 RNase-Free dH2O 至 10μl。B 液 l0μl， 包 括 5 ×M-MLVbuffer 4.0μl，dNTP Mixture(10mmol/L)2.0μl，RNase Inhibiter(40U/μl)1.0μl，M-LV Reverse Transcriptase (5U/μl)0.5μl，RNase-Free H2O 2.5μl。按照說明書操作步驟，混合A液與B液，制備成20μl反應體系，42℃水浴60分鐘，72℃水浴10分鐘進行mRNA反轉錄反應。反轉錄成的cDNA-20℃冰箱保存。

表1 CXCL6基因引物列表

（三）Real-time PCR

使用SYBR Prelnix Ex TaqTM試劑盒進行，以cDNA樣本為模版對CXCL6基因進行Real-time PCR反應。CXCL6基因引物通過Primer5軟件設計（表1）。根據試劑盒說明及引物的條件設定RT-PCR的反應程序為： 預變性 95°C 10 min;95°C 30s；95°C 5s；55°C 30s；72°C 34s，擴增40個循環。反應體系模版分別來自三組不 同 窩 別 出 生 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 日齡的 21 個時間節點的大鼠睪丸組織cDNA。每個時間節點的樣品重復檢測兩管，以GAPDH做為內參對照，以H2O做為陰性對照。用Ct方法分析CXCL6 mRNA的表達量，結果用基因mRNA相對表達倍數表示。計算方法用2-ΔΔCt法，數據和圖表使用Microsoft Excel分析。

（四）免疫組織化學染色

取65日齡大鼠的睪丸組織石蠟切片,烤片、脫蠟水化。PBS洗三次，每次5min，微波15 min進行組織抗原修復。切片滴加過氧化酶抑制劑室溫處理10 min之后PBS洗三次，每次3min。滴加兔抗大鼠CXCL6（GCP-2）抗體（1：80），濕盒中 4℃過夜，以 PBS 替代一抗做為空白陰性對照。次日，PBS洗三次，每次3min，滴加HRP-羊抗小鼠／兔IgG,室溫孵育10min。PBS淋洗后，滴加H2O2-DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片。在顯微鏡下觀察，拍照。

結 果

一、Real-time PCR檢測CXCL6基因表達

引物的溶解曲線重合度高，可知其特異性好（圖1 A，C），擴增曲線在PCR平臺期幾乎重合（圖1 B，D）。

圖1 CXCL6和Gapdh的基因擴增熔解曲線與擴增曲線

通過Real-time PCR反應檢測三組不同窩別來源，出 生 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 日齡，21 個不同時間節點的大鼠睪丸組織中的CXCL6基因表達。三組不同窩別來源的大鼠睪丸組織中，CXCL6 mRNA水平表達變化趨勢基本相同，在大鼠出生的第2到65天呈動態變化。

CXCL6 mRNA表達在出生后第2天呈高表達，隨后開始迅速下降，在第8天下降到最低值，并且一直持續到第16天。從第20天起迅速線性升高表達，在第29天時達到整個發育過程的最高值，之后開始下降。第35天起CXCL6基因的表達再次呈現升高趨勢，在第45天形成一個小高峰表達之后，維持一定的表達量持續至第 65 天（圖 2）。

圖2 CXCL6基因在3組不同窩別出生2至65日齡大鼠睪丸組織中mRNA的相對表達量

圖3 65日齡大鼠睪丸組織免疫組織化學染色

二、免疫組織化學染色檢測CXCL6蛋白在65日齡大鼠睪丸組織中的表達

65日齡大鼠睪丸組織免疫組織化學染色顯示，曲細精管內可見CXCL6蛋白陽性表達的細胞。在精母細胞邊緣和圓形精子以及曲細精管管腔的成熟精子處均呈現陽性信號（圖3）。

討 論

睪丸的曲細精管是精子生成的場所。精子發生包括精原干細胞的增殖與分化，減數分裂和成熟精子形成等三個階段[8]。每個階段都是多基因參與的復雜的調控過程。Wrobel G等[9]研究表明，大鼠出生后1-8天以精原干細胞的自我增殖和分化為主；出生后14天左右開始減數分裂，出現初級精母細胞；出生20天之后進入圓形精子發生階段，此時第二次減數分裂完成，圓形精子首次出現；出生35天后完成圓形精子向長形精子的變形，形成成熟的精子；出生56天后大鼠性成熟，達到成年狀態[10]。

本研究對大鼠出生后第 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 天的睪丸組織進行CXCL6基因表達檢測。觀察到CXCL6基因在大鼠精子發生過程中，轉錄水平表達呈動態變化。在大鼠出生后第2天CXCL6基因mRNA呈高表達，隨后迅速下降，在第8天下降到最低值，一直持續到第16天。根據Wrobel G等和劉陶迪[11]等的研究結果，該時期是大鼠精原干細胞增殖分化的關鍵時期，推測CXCL6基因可能通過調低表達，參與精原干細胞的增殖過程。

從第20天起CXCL6基因表達量迅速線性升高，在第29天時可達到整個發育過程的最高值，之后開始下降。研究表明大鼠出生20天之后進入圓形精子發生階段，此時第二次減數分裂剛完成，圓形精子首次出現[12]。第20天后CXCL6 mRNA水平升高，提示減數分裂以后，CXCL6可能通過高表達參與與圓形精子的形成。從第35天到大鼠性成熟，圓形精子細胞核發生聚縮和塑性，經過復雜的變態發育，向長形精子變形，形成成熟的精子。第35天可見CXCL6基因的表達再次呈現升高趨勢，在第45天形成一個小高峰之后，維持一定的表達量持續至第65天。由此推測CXCL6基因可能與圓形精子細胞變態轉變為長形精子以及長形精子的成熟有關。65日齡大鼠睪丸組織免疫組織化學染色顯示曲細精管內可見CXCL6蛋白陽性表達的細胞。CXCL6蛋白位于精母細胞邊緣和圓形精子處，提示CXCL6在減數分裂后期表達，支持該基因參與圓形精子形成的推斷。CXCL6蛋白在長形精子處表達也提示CXCL6基因在長形精子成熟的過程中發揮重要的作用。

臨床研究提示男性生殖能力降低與頂體發生及頂體反應異常有關[13]。 田洪艷[14]等報道，圓形精子細胞期是頂體發生的重要時期，此期內圓形精子細胞核變形的同時，頂體從無到有，逐漸變大，從圓形變成帽形，經歷復雜的演變，形成正常結構和功能的頂體。頂體伴隨著精子形成過程，也對精子形成過程發揮重要的作用[15]。本研究發現CXCL6陽性信號表達部位與頂體發生的部位相似[16]。實時定量PCR檢測結果也支持CXCL6基因在減數分裂之后圓形精子形成階段升高表達，可達到整個精子發生過程的最高峰值，提示CXCL6基因可能通過與頂體形成相關，對精子形成產生影響，具體的作用機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究認為CXCL6基因可能參與精原干細胞的增殖；可能與頂體形成相關，在圓形精子的形成以及精子成熟的過程中發揮作用，可能是大鼠精子發生過程，分子調控機制中的重要環節，為揭示該基因男性生殖相關的作用提供了初步的線索。