338例少弱精、無精子癥患者ICSI助孕結局分析

劉 麗 曹曉敏 張暄琳 邸建永 徐鳳琴

天津市第一中心醫院生殖醫學科（天津 300192）

據資料統計在育齡夫婦中不孕不育夫婦約占15%，其中有30-50%為男方因素不育[1]。卵胞漿內單精子注射技術（intracytoplasmic sperm injection ICSI）解決了多數男性不育問題，對精子的數量、質量要求均大為降低。理論上只要獲取一個活的精子，結合輔助生殖技術，就可能受精、妊娠。無精子癥患者通過外科手術取精并借助輔助生殖技術可以擁有自己的遺傳學后代。梗阻性無精子癥（obstructive azoospermia OA）患者可通過經皮附睪穿刺取精術 （percutaneous epididymal sperm aspiration PESA）、非梗阻性無精子癥患者 （non-obstructive azoospermia NOA）通過睪丸精子抽吸術（testicular sperm aspiration TESA）獲取精子[2]，但部分患者通過TESA仍不能獲得精子，隨著男科手術技術的發展，睪丸切開顯微取精術 （microdissection testicular sperm extraction MD-TESE）日漸普及，目前MD-TESE結合ICSI已經成為治療NOA的金標準。為此類患者帶來生育自己后代的希望，由于不同來源精子的發育成熟過程及成熟度均不相同，文獻對射出精子、附睪穿刺精子及睪丸穿刺精子的助孕結局報道不一[3,4]，MD-TESE與少弱精子組、重度少弱精子組、PESA、TESA行ICSI的臨床結局的報道較少。本結果選擇單純男方因素不孕而行ICSI助孕治療患者作為分析對象，旨在為臨床治療提供依據。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2015年1月至2019年11月在我院生殖醫學科接受ICSI治療共338周期。入選標準：（1）夫妻雙方染色體均正常；（2）女方年齡≤38歲，月經周期規律，基礎FSH＜15mU/mL）；（3）男方因素不孕。排除標準：（1）早補救 ICSI，晚補救 ICSI，前次 IVF 受精失敗行ICSI（2）女方子宮肌瘤、子宮內膜異位癥等；依據精子質量分為少弱精子組167例、重度少弱精子組92例，無精子癥分為PESA組33例，TESA組24例，MD-TESE組22例。本研究獲天津市第一中心醫院倫理委員會批準(倫理批號2019N069KY)，所有受試者均簽署知情同意書。

二、方法

（一）促排卵方案及取卵

采用常規長方案、短方案或拮抗劑方案控制行卵巢刺激，當至少有2個優勢卵泡直徑達到17mm，肌注絨毛膜促性腺激素5000-10000IU，36小時后在B超引導下經陰道后穹隆穿刺取卵。卵子培養3h，透明質酸酶消化去除卵冠丘復合物外的顆粒細胞，排出第一極體的成熟卵子（MII）待行ICSI。

（二）精子獲取及處理

常規射精：患者禁欲2～7天，取卵當日采用手淫方法留取精液標本，應用密度梯度離心法或直接離心法處理精液，收集活動精子待行ICSI。少弱精子癥和重度少弱精子癥診斷標準參考WHO人類精液檢查與實驗室處理手冊(第5版)，即男方3次精液常規檢查至少2次符合以下任一標準：1.精子濃度<15×106/ml；2.前向運動精子百分率<32%；重度少弱精子癥：1.精子濃度<5×106／ml；2.前向運動精子百分率 <10%；

MD-TESE及TESA：將獲取的睪丸組織置于解剖顯微鏡下，用兩支1ml注射針撕碎睪丸組織，去除黏附的血塊、雜質，劃破并擠壓曲細精管，使精子被分離出來，在倒置顯微鏡下檢測有無精子。若有精子，收集含精子的洗滌液，室溫孵育40-60min，待大塊組織沉淀，吸取上層液離心1000rpm 10min，行直接離心法處理，精子懸液放入37℃培養箱內孵育待行ICSI。

PESA：患者經皮附睪精子抽吸術，取出附睪液體，倒置顯微鏡下鏡檢有無活動精子，有活動精子行直接離心法處理，放入37℃培養箱內孵育待行ICSI。

（三）受精、胚胎評估

常規行ICSI受精，16-18h觀察原核，雙原核和兩個極體為正常受精。

（四）胚胎移植

根據卵裂球的數目，均一性及碎片比例評分，第三天7-9細胞I-II級胚胎為優質胚胎。選擇1-2個優質胚胎移植，冷凍1-2個優質胚胎，剩余胚胎進行囊胚培養。

（五）妊娠判定及觀察指標

移植14天后行尿、血絨毛膜促性腺激素測定確定是否妊娠，移植后28天陰道B超檢查，見孕囊及心血管搏動為臨床妊娠。

（六）觀察指標

2PN受精率=D1 2PN數/MⅡ卵子數；優質胚胎率=優質卵裂胚胎總數/2PN卵裂胚胎數；可利用胚胎率=移植胚胎數+冷凍胚胎數/2PN卵裂胚胎數；囊胚形成率=2期及2期以上囊胚數/行囊胚培養的卵裂期胚胎數；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數／移植周期數×100%；種植率=B超下見孕囊數／移植胚胎數×100%；早期流產率=妊娠12周流產的周期數／臨床妊娠周期數×100%；

（七）統計學處理

采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差(Mean±SD),組間比較進行t檢驗。分類變量以率(%)表示，組間比較采用X2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組患者臨床基礎資料比較

五組患者男、女方年齡、女方抗繆勒氏管激素水平、體質量指數BMI、基礎卵泡刺激素（FSH）、促性腺激素（Gn）使用天數、Gn總量、移植前內膜厚度、平均獲卵數、MII卵數、平均移植胚胎數差異均無統計學意義（P＞0.05）見表 1。

表1 五組患者臨床基礎資料

二、五組患者臨床結局比較

MD-TESE組與其他四組相比，2PN受精率差異有統計學意義（P＜0.05），少弱精子、重度少弱精子、PESA、TESA組2PN受精率相比差異無統計學意義 （P＞0.05）；各組間優質胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、早期流產率差異無統計學意義（P＞0.05）；重度少弱精子組臨床妊娠率、種植率低于其他四組，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表 2。

表2 五組患者臨床結局比較

討 論

1992年ICSI技術[5]的應用使精液質量差及無精子癥的患者均可通過ICSI獲得妊娠，射精獲得精子和通過手術從附睪或睪丸獲得精子相比較，理論上其核成熟度、精子運動能力及膜表面蛋白分子存在差異，不同來源的精子是否影響胚胎發育及臨床妊娠結局備受關注。

本研究少弱精子、重度少弱精子、PESA、TESA組相比2PN受精率、優質胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、早期流產率差異無統計學意義。馮翠娥等[6]比較射出精子組、附睪穿刺精子組及睪丸精子組的受精率、臨床妊娠率和早期流產率，差異無統計學意義。我們的結果與文獻報道相符[7]。精子從產生到排出體外，在體內經歷了睪丸和附睪內的一系列成熟過程，附睪是精子成熟的主要場所，包括精子核的成熟、頂體外膜抗原分布改變以及精子質膜通透性改變等，最終才能使精子獲得運動能力及受精能力。ICSI避開了常規受精過程中精子獲能、精子與卵子透明帶識別黏附、頂體反應、精子與卵胞膜融合等步驟，人為選擇單一精子直接注射入卵胞漿內完成受精，PESA組患者不孕原因多為輸精管梗阻，自身生精功能無明顯異常。睪丸精子成熟率低、密度少、活動力差，但不影響其所形成胚胎的發育潛能，選用形態正常的活動精子借助ICSI，仍然可以獲得高的受精率、種植率、臨床妊娠率。

重度少弱精子組的臨床妊娠率、種植率低于其他四組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。由于重度少弱精子患者睪丸生精功能低下或障礙或基因缺陷、陰囊血運異常、內分泌紊亂或免疫因素引起的精子生成過程異常，表現為嚴重的精子數量、活動力、形態及遺傳物質異常，造成精子數目過少、活力差，且精液中包含大量白細胞、受損精子及未成熟精子，使精液中活性氧水平大大增高，極易誘發氧化應激[8]，導致精子DNA碎片率增高，精子功能降低[9]，妊娠率下降。Gharagozloo等[10]報道也認為，從氧化應激反面方面來考慮，嚴重少、弱精子癥患者精液中由于未成熟精子、損傷精子、形態異常精子及過量白細胞等的存在而導致精液中活性氧水平增加并引起氧化應激反應，而氧化應激誘導的精子損傷影響受精后的胚胎發育能力。

非梗阻性無精子癥約占無精子癥人群的60%[11]，是男性不育中最嚴重的一種疾病，是由于各種原因導致的睪丸生精功能衰竭，精子發生障礙[12]，傳統TESA只是隨機獲取部分睪丸組織或生精小管，未獲精的患者只能依靠供精。近年研究顯示睪丸精子發生是局灶性和不均一的，即使睪丸大部分生精小管內未找到精子，并不能排除小部分生精小管內存在精子，由于NOA存在局灶性生精的理論基礎，MD-TESE在顯微鏡下操作，可以直接辨別可能含有精子的白色不透明的生精小管，更具有針對性。NOA患者通過MD-TESE成功獲得精子概率為20%～60%[13]，比TESA有更好獲精率和更少的術后并發癥[14，15]。MD-TESE結合ICSI使這些患者能有自己的生物學后代[16，17]。MD-TESE與其他來源精子ICSI結局比較鮮見報道。本研究MD-TESE組2pn受精率73.02%，低于其他四組，差異有統計學意義。這是由于顯微取精局部生精小管中獲精與TESA患者相比，睪丸生精能力更差，取出的精子極少，畸形率高，成熟精子比例較低，影響卵子激活，從而影響正常受精。Hatsuki等[18]報道顯微取精受精率73.5%，我們的結果與報道一致。MD-TESE組與其他組比較雖然受精率較低但優質胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、臨床妊娠率、種植率、早期流產率差異無統計學意義（P＞0.05），說明睪丸精子已經完成減數分裂，成為已攜帶父源遺傳物質的單倍體和受精卵形成必需的中心粒，具備了使卵子受精后進一步卵裂、發育形成正常胚胎的能力。劉貴華等[19]比較了顯微取精和重度少精子癥患者種植率和臨床妊娠率差異無統計學意義。孫建華[20]報道ICSI周期MD-TESE的NOA患者和睪丸穿刺取精術的OA患者的優質胚胎率、臨床妊娠率，流產率差異無統計學意義。說明不同來源的精子受精之后的胚胎發育潛能相似。

綜上所述，少弱精子、重度少弱精子及PESA、TESA、MD-TESE結合ICSI均可作為男方不育患者的助孕手段，單純男方因素不育患者無論是來源于睪丸、附睪，還是嚴重少弱精子癥患者射出的精子行ICSI，對妊娠結局無明顯影響。只要能獲得一定數量和質量較好的可移植胚胎，均可獲得滿意的臨床妊娠結局。此外由于本研究樣本量小，數據僅限于胚胎植入后的臨床妊娠、胚胎早期發育，仍需進一步擴大樣本量隨訪胎兒發育及出生結局。