微塑料（MPs）與三氯生（TCS）復合暴露對普通小球藻的毒性研究

俞博浩 張德勇

【摘 ?要】為分析微塑料（MPs）與三氯生（TCS）兩種污染物聯合暴露對普通小球藻的毒性效應，首先通過單獨染毒實驗證實了MPS、TCS均會抑制藻類的增殖速度，其96h-EC50值分別為95.85和17.46 mg/L，且檢測到葉綠素含量、抗氧化酶活力、可溶性蛋白含量下降及MDA含量升高。聯合染毒實驗進一步證實了MPs與TCS復合暴露時仍會出現上述毒性效應，但各指標的聯合毒性普遍低于單獨染毒的效應加和值，即呈現出一定的拮抗效應。另外，不同劑量組的比較顯示，當染毒物質劑量提高后，這種拮抗效應通常會有所減弱。

【關鍵詞】微塑料（MPs）;三氯生（TCS）;普通小球藻;復合暴露;毒性效應

微塑料（MPs）指直徑小于5 mm的塑料碎片、顆粒及纖維，因其體積小而易于進入生物體內[1]。塑料的使用已有100多年歷史，近年來微塑料幾乎在世界各地的水域被檢測到。據分析，北太平洋副熱帶環流中微塑料的數量高達32.76個/m3和250 mg/m3[2]。我國渤海海岸微塑料達103-163個/kg，海水浴場等人類活動頻繁的地區尤其高。除了海洋，在淡水生態中也發現了微塑料，我國太湖表層水中豐度可達3.4-25.8個/L，沉積物中的微塑料為11-235 個/kg[3]。三氯生（TCS）則是一種化工產品，作為殺菌劑被廣泛添加于紡織品、洗衣粉、除臭劑、護膚品和個人衛生用品中。TCS長期被大量生產和應用，全世界年使用量估計在750×103噸以上。生物降解和光降解不足以高效清除TCS，加上其強親脂性，使得TCS在環境中的濃度不斷上升，并在生物體內逐漸富集。目前，環境中已經普遍污染有TCS，國內外陸續有在環境中檢出TCS的報道[4]。MPs與TCS已經成為當前水環境中比較常見的兩種污染物，甚至在各級生物的體內也普遍檢測到了它們的存在，因此它們對生態系統的威脅一直是備受關注的熱點環境問題，其生態毒性值得深入研究。

藻類是水生生態系統中的初級生產者，處于食物鏈底端，評價MPs和TCS對藻類的毒性效應可以為全面認識其生態危害提供很好的切入點。盡管有少量報道證實MPs對藻類的毒性可表現為可抑制細胞生長、破壞細胞膜結構、降低葉綠素含量和光合效率、引起細胞氧化損傷等，且毒性大小與微塑料本身的種類、大小、濃度等有關[5-7]。但總體而言，當前關于MPs、TCS的毒性效應及其機制的研究尚不夠系統，針對藻類的研究尤其不足。且當前研究絕大多數采用了MPs單獨染毒方式，獲得的結果遠遠不能反映實際環境中MPs因和其他污染物共同存在可能導致的復合效應。為分析MPs與其他污染物聯合暴露對淡水藻類具有何種效應并初步揭示其產生機制，本研究擬評價不同劑量的MPs與TCS聯合染毒后，對普通小球藻的增殖、光合作用、抗氧化能力等方面的毒性效應及其與單獨染毒的差異。

1 材料與方法

1.1 藻類培養及染毒方案

普通小球藻（Chlorella vulgaris）購自中科院水生所;培養基為水生4號;培養條件為25℃、12h/12h光暗循環[8]。染毒實驗中，MPs設計了1.34、11.47 mg/L兩個劑量，TCS設計了0.077、0.230 mg/L兩個劑量，然后按照下文中表1所示的方案，進行單獨與聯合染毒，染毒后繼續培養96h然后分析各指標。

1.2 藻類生物量的光密度分析法的建立

首先對藻液進行全波長掃描，找出特征吸收峰。然后分別利用吸光度法與顯微鏡計數法建立藻濃度與吸光度值之間的回歸方程。

1.3 藻類的生長抑制效應分析及96h-EC50值計算

基于A690值繪制生長曲線，建立抑制率P和濃度的自然對數LnC的線性回歸關系，求解抑制率為50%的濃度值即EC50值。抑制率P（%）=（對照組A690-處理組A690）/對照組A690

1.4 藻類的葉綠素含量測定

藻液用高速離心法提取，加1.5mL乙醇和少許石英砂研磨，轉入離心管定容到10mL，于4℃黑暗提取12h;4000rpm離心10min;上清于比色管中用90%乙醇定容10mL。于比色皿中，測吸光值。葉綠素a濃度（mg/L）=（11.64A633+2.16A645+0.10A630）V1/1000V2。式中V1為提取液定容體積（mL）;V2為濾液體積（L）。

1.5 抗氧化酶活性測定

1.5.1 SOD活性測定

收集藻細胞，研磨、離心，取上清為SOD粗提液。采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活力，再按照2.35mL Tris-HCl緩沖液、1.8mL蒸餾水、0.15mL鄰苯三酚溶液、200μL樣液的反應體系測定ΔA325。U=[（A325-ΔA325）/ΔA325×100%]/50%×Vs×D/V總。

1.5.2 POD活性測定

藻細胞破壁后，上清充分轉入25mL容量瓶定容。取比色皿加入反應混合液3 mL和酶液1 mL。立即開啟秒表記錄A470，每隔1 min讀數1次，共5 min。U=（A470×0. 01×W ×t）×樣品稀釋倍數。

1.5.3 CAT活性測定

藻細胞破壁后，加入3mL0.05mol/L pH7.8 PBS，再加入200μL 30%H2O2迅速搖勻，1分鐘后開始，每1 min記錄1次A240，連續記錄5min。U=ΔA240×Vt/W/Vs/0.01/t。

1.6可溶性蛋白含量測定

取4mL藻液，離心后沉淀重懸于10?L Loarding buffer，煮沸10 min，離心取上清，SDS-PAGE電泳分析蛋白表達。另外，取破壁離心后的上清于1 cm光程石英比色皿中測定A280值和A260值，按公式計算可溶性蛋白含量。

1.7 MDA活性測定

藻液離心后加10%TCA研磨，勻漿液12000rpm離心10min。取2mL上清于試管，加入0.6%硫代巴比妥酸2mL，沸水浴10min。4500rpm離心10min，取上清測吸光度。MDA濃度=6.45（A532-A600）-0.56×A450。

1.8 統計分析

采用SPSS軟件的單因素方差分析法（One Way ANOVA）分析處理組與對照組之間的差異顯著性，p<0.05為顯著。

2 結果

2.1藻類生物量的光度分析法的建立

連續波長掃描顯示，普通小球藻在690 nm處有較明顯的吸收峰，可用于建立藻類生物量的分析方法;故基于藻液的密度與其A690值之間的規律性建立了線性回歸方程：y=0.025x+0.0403;R?=0.9613。二者具有較理想的線性關系，可用于快速測定藻類生物量。

2.2 MPs、TCS染毒對普通小球藻的增殖速度的影響

如圖1所示，MPs及TCS單獨染毒對小球藻均有抑制效應，其96h-EC50值分別為95.85 mg/L和17.46 mg/L。聯合染毒則均呈現為拮抗作用，即MPs+TCS聯合染毒引起的抑制率小于單獨染毒的抑制率之和。

2.3 MPs、TCS染毒對普通小球藻葉綠素含量的影響

各組的葉綠素含量結果為：陰性對照組1.367 mg/L、M1組0.148 mg/L、M2組0.572 mg/L、T1組0.847 mg/L、T2組0.843 mg/L、M1T1組0.549 mg/L、M1T2組1.028 mg/L、M2T1組 0.681 mg/L、M2T2組0.698 mg/L。因此，MPs、TCS單獨染毒均導致了小球藻葉綠素含量下降。4個聯合染毒組的降幅（依次為0.818、0.339、0.686、0.669 mg/L）均小于相應的單獨染毒組的加和值（依次為1.739、1.743、1.315、1.319 mg/L），故聯合效應主要表現為拮抗效應。

2.4 MPs、TCS染毒對普通小球藻抗氧化酶活性的影響

單獨染毒下三種物質對藻類的抗氧化酶活性均有抑制效應（p<0.05）。聯合效應可通過比較聯合染毒組的抑制值與單獨染毒組的抑制值進行比較判斷（表1）。如表1所示，對于SOD活力，4個聯合染毒組的抑制值分別為7.732、9.181、8.215、10.148 U/g，均小于相應的單獨染毒組的加和值（依次為10.148、13.047、12.081、14.980 U/g）;對于POD活力，4個聯合染毒組的抑制值分別為0.402、0.454、0.418、0.485 U/g，均小于相應的單獨染毒組的加和值（0.671、0.720、0.695、0.744 U/g）;對于CAT活力，4個聯合染毒組的抑制值分別為36、40、36、48 U/g，均小于相應的單獨染毒組的加和值（32、52、48、68 U/g）;因此對于3種抗氧化酶，聯合染毒組的抑制值均小于單獨染毒直接相加之和，故MPs與TCS聯合染毒時對抗氧化酶的抑制效應均呈現為拮抗效應。

2.5 MPs、TCS染毒對普通小球藻可溶性蛋白含量的影響

各組的可溶性蛋白含量結果為：陰性對照組1.169 mg/mL、M1組1.064 mg/mL、M2組0.928 mg/mL、T1組0.614 mg/mL、T2組0.731 mg/mL、M1T1組0.534 mg/mL、M1T2組0.674 mg/mL、M2T1組 0.629 mg/mL、M2T2組0.752 mg/mL。MPs和TCS染毒均導致小球藻的可溶性蛋白含量下降。4個聯合染毒組的降幅（依次為0.635、0.495、0.540、0.417 mg/mL）均小于相應的單獨染毒組的加和值（依次為0.660、0.543、0.796、0.680 mg/mL），故聯合染毒均表現為拮抗效應。

2.6 MPs、TCS染毒對普通小球藻MDA含量的影響

各組的可MDA含量結果為：陰性對照組0.295 mg/mL、M1組0.993 mg/mL、M2組1.179 mg/mL、T1組0.932 mg/mL、T2組0.883 mg/mL、M1T1組0.467 mg/mL、M1T2組0.877 mg/mL、M2T1組0.733 mg/mL、M2T2組0.191 mg/mL。MPs和TCS染毒普遍導致小球藻的MDA含量升高。4個聯合染毒組的升幅（依次為0.172、0.582、0.438、-0.104 mg/mL）均小于相應的單獨染毒組的加和值（依次為1.335、1.286、1.521、1.472 mg/mL），故聯合染毒均表現為拮抗效應。

3討論

當前MPs、TCS已成為引人關注的重要污染物。水中的MPs會被生物誤以為浮游生物而主動對其進行捕食，從而進入生態系統的食物鏈。研究發現許多水生動物的胃、消化管、肌肉等組織和器官中均含有微塑料存在。近來甚至在人體內也普遍檢測到了微塑料的存在，且種類多達數十種。TCS也被國內外眾多研究者證實對許多生物具有的毒性效應，且影響的器官系統不一而足，包括生殖毒性、內分泌干擾效應、肝腎毒性、免疫系統毒性、DNA損傷與遺傳毒性等[9-11]。藻類是水生生態系統的生產者，MPs對藻類的影響關系到整個水生生態系統的維系。在本研究中，MPs被證實能抑制普通小球藻的增殖，并引起葉綠素含量、抗氧化能力等的下降等，這一結論與與以往在其他藻類上的研究報道基本一致（雖然以往某些研究稱觀察到同時促進和抑制藻類生長的所謂“雙重效應”，但屬于個例，在本研究所采用的普通小球藻上未觀察到此情況）。同時，與以往研究不同，本研究更側重于考察MPs與其他污染物聯合暴露時呈現的毒性效應。除了葉綠素指標有點例外，在所研究的絕大多數指標中，我們均證實了MPs、TCS聯合暴露時，會呈現一定的拮抗效應，即聯合毒性低于兩種物質單獨暴露引起的毒性之和。這一現象以往罕有探討，初步分析其原因可能是MPs具有較強的吸附性和漂浮性，導致其他污染物能被吸附在其顆粒上而無法發揮對藻類的毒性。另外，結果也顯示當染毒劑量雙雙升高時，拮抗效應往往有所減弱。

本研究在評估藻類的狀態采用了葉綠素、抗氧化狀態、蛋白表達、可溶性蛋白含量幾個重要指標。葉綠素是光合作用的執行者，測定葉綠素含量可以了解植物物質轉化的程度和速度，其含量高低直接反映藻類的生長繁殖能力。從本研究的結果看，MPs和TCS對葉綠素含量有嚴重的影響，雖然聯合染毒有一定的拮抗效應，但對于緩解這種毒性效應實際意義不大。藻類的抗氧化能力的強弱與健康程度存在著密切聯系，抗氧化酶的活力有助于大致藻類的健康狀況。為了充分評估普通小球藻的抗氧化狀態，分別測定了3種抗氧化酶的活力。其中SOD是負責清除氧自由基的酶，POD藻類體內負責分解過氧化物的酶，CAT是能夠催化過氧化氫分解為水和分子氧，這三者均是藻類抗氧化損傷、清除代謝廢物的關鍵物質，對藻類的生長代謝非常重要。從本研究的結果看，MPs和TCS對小球藻的三種抗氧化酶均有顯著影響，可導致其活性顯著降低。單獨染毒組引起SOD活力的降幅在4.349-7.732 U/g，聯合染毒組引起的降幅在7.732-10.148 U/g范圍;單獨染毒組引起POD活力的降幅在0.283-0.412 U/g，聯合染毒組引起的降幅在0.402-0.485 U/g范圍;單獨染毒組引起CAT活力的降幅在16-36 U/g，聯合染毒組引起的降幅在36-48 U/g范圍。可溶性蛋白質有助于藻類對抗環境脅迫，還能增加細胞滲透濃度和功能蛋白的數量，有助于維持細胞正常代謝，因此也是反映抗逆狀態的指標。在本研究中，低劑量的MPs對可溶性蛋白產生的毒性效應微小，但POFS結合后則會產生協同作用，大大增強TCS對可溶性蛋白的毒性。MDA是膜脂過氧化作用的最終分解產物，其含量反映藻類遭受逆境傷害的程度。MPs在本研究被證實對藻類的細胞膜能夠造成嚴重危害，并且在MPs與TCS聯合染毒中對MDA含量存在著協同作用。這進一步增強了染毒物對藻類細胞膜的破壞。

本研究的結果顯示，水體中多種污染物同時存在時，其聯合效應非常復雜和微妙。如微塑料雖然對藻類有明顯的毒性，如破壞其光合作用、損害其抗氧化能力、影響某些生化分子的濃度等，但同時也可能在一定程度上減緩了其他污染物的毒性。當然，本研究僅僅是對聯合毒性效應的初步探索，其中涉及的具體分子機制尚待進一步揭示，例如微塑料與其他污染物的拮抗效應是通過何種機制發生的？是僅僅由于物理性的吸附，還是涉及到某些化學變化？微塑料與其他污染物相結合及解離的規律性是怎樣的？諸多問題值得進一步探討。

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作者簡介：

俞博浩，2000年6月出生，男，漢族，浙江舟山人，本科生，研究方向為生物工程。

通訊作者：

張德勇，1978年4月出生，男，漢族，山東聊城人，博士生，教授，研究方向為毒理生態學。

基金項目：

本研究受浙江樹人大學實驗室開放項目（2021JS3012）資助