卵型家族蛋白轉錄因子AtOFP8的抗旱性功能分析

劉守銀，唐 堯，韓佳良，常 纓

(東北農業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

卵型家族蛋白(Ovate family proteins, OFPs)是植物特異性轉錄因子家族[1]，參與調控植物的生長和發育的多個方面，該蛋白家族的特征是具有保守的OVATE結構域，在OVATE蛋白質的羧基末端包含一個由70個氨基酸組成的保守結構域，OVATE基因首先在番茄中被鑒定為果實形狀的關鍵調控因子[2]。該蛋白質在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、番茄(Solanumlycopersicum)[1]和水稻(Oryzasativa)[4]中均是保守的。在擬南芥卵形家族蛋白(AtOFPs)具有多種生物學功能，如AtOFP1作為一種轉錄阻遏物，可通過控制赤霉素生物合成酶AtGA20ox1的表達來調節細胞的伸長[5]；AtOFP4與KNAT7的相互作用可以調節擬南芥中次生細胞壁的形成[6]；AtOFP15和AtOFP16參與調控擬南芥莢果的形態發育[7]。

東北農業大學生命科學學院常纓教授課題組的前期研究發現，Columbia野生型擬南芥(Col)的表皮蠟質分布比Atofp8-1突變體更多，并且低于35S∶HA-AtOFP8的植株，說明AtOFP8能夠增加擬南芥表皮蠟質的積累[8]，植物表皮蠟質具有限制水分蒸騰的作用，進而保護植物體內水分散失[9]。在干旱條件處理擬南芥發現，AtOFP8的轉錄水平明顯上升，推測AtOFP8可能參與抵抗干旱脅迫的生物過程[10-11]。

有研究報道，水稻OsOFP6的過表達會引起失水速度和H2O2積累降低，而RNAi植物的失水速度和H2O2含量積累更快，表明OsOFP6可以提高水稻的抗旱性[12]。因此，本研究以AtOFP8作為研究對象，從擬南芥種子萌發率及幼苗生長、質膜穩定性、抗氧化酶活性和滲透調節能力及干旱應答基因表達水平的角度，探索轉錄因子AtOFP8在擬南芥應對干旱脅迫中的作用，以期為利用該基因提高擬南芥的抗旱性奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗應用Columbia野生型(Col)、Atofp8-1突變體和35S∶HA-AtOFP8擬南芥為試驗材料，試驗材料由東北師范大學王樹才教授提供。擬南芥的生長培養條件：溫度23 ℃，光周期為16 h/8 h(光照/黑暗)。

1.2 試驗方法

1.2.1 AtOFP8基因突變體及過表達體的鑒定 根據已知的AtOFP8基因(At5g19650)設計引物，AtOFP8基因的正向引物和反向引物分別為5′-TT CTTTGCTCATACGGTCA-3′和5′-GGAGAGAACAAG GTGGCATAAA-3′, 以擬南芥中ACTIN2為內參基因，正向引物和反向引物分別為5′-CTCGTTGTCCT CCTCACTT-3′和5′-TTCTTTGCTCATACGGTCA-3′，應用PCR技術對Atofp8-1突變體和35S∶HA-AtOFP8植株進行鑒定。

1.2.2 干旱脅迫下擬南芥植株表型觀察及生理指標分析 將Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8擬南芥種子分別種在甘露醇濃度為0，200，300 mmol/L的1/2 MS培養基中，每個平板中播50粒擬南芥種子，觀察分析種子的萌發狀況及子葉變綠狀況，以胚根突破種皮 1 mm即視為萌發，子葉完全變綠才計為綠葉。

擬南芥植株培養21 d時，對照組生長環境不變，干旱試驗的植株停止澆水，拍照記錄植株變化。分別在干旱試驗開始后的第5，10，15天取對照組和試驗組植株的葉片，液氮速凍用于測定生理指標。丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[13]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法測定[14]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定[15]；脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮比色法測定[16]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法[17]。

1.2.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)試驗 實時熒光定量PCR反應系統為Mx-3000p Real-time PCR Systerm。根據AtADH1基因(AT1G77120)設計的正向引物和反向引物分別為5′-TGTGACCGAGTGTGTGAACCC-3′和5′-GATGAGTCTTGAAGGCATCGTCT-3′，AtRD26基因(AT4G27410)的正向引物和反向引物分別為5′-TGG AAAGCAACGGGTACTGAC-3′和5′-TCCAGATGTTTT CTTGTAAATTCGAC-3′，AtRDUF2基因(AT5G59550)的正向引物和反向引物分別為5′-GATTCGCCGTA GGGAGGTTTA-3′和5′-GAACCTGAGCCAGTACCGT TAC-3′，AtERD7基因(AT2G17840)的正向引物和反向引物分別為5′-AAGCGAAGGAAGCAGGTGAAA-3′和5′-TCCCCAAATAAGCCTATCCATAGTC-3′，AtOFP8基因(At5g19650)的正向引物和反向引物分別為5′-CCCACCAAACCCTTTCTACGA-3′和5′-GGGTCAGAA CCAAACTGCGAT-3′，以擬南芥中ACTIN2為內參基因，正向引物和反向引物分別為5′-TGGGTTTTTACT TACGTCTGCG-3′和5′-GGGAACAAAAGGAATAAAGA GGC-3′。取3次生物學重復的平均值，用軟件SPSS分析對照組與試驗組的數據顯著性。

2 結果與分析

2.1 AtOFP8基因突變體及過表達植株的鑒定

如圖1所示，與Col植株相比，35S∶HA-AtOFP8過表達擬南芥中植株AtOFP8基因的轉錄水平增加，Atofp8-1突變體植株中未檢測到AtOFP8基因的轉錄。

2.2 AtOFP8對干旱擬南芥種子萌發率及幼苗生長的影響

2.2.1 種子萌發率 在對照組中，Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株種子萌發率無顯著差異，且在第4天時，萌發率為100%(圖2-A)；在200 mmol/L甘露醇處理5 d時，35S∶HA-AtOFP8和Col植株種子萌發率為100%，Atofp8-1植株種子萌發率為88%，在7 d時，Atofp8-1植株萌發率為100%(圖2-B)；在300 mmol/L甘露醇處理7 d時，Col 和35S∶HA-AtOFP8植株種子萌發率為100%，而Atofp8-1植株種子萌發率僅為76%(圖2-C)，表明干旱脅迫嚴重抑制了Atofp8-1植株種子萌發率。

圖1 Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株的鑒定Fig.1 Molecular identification of the Atofp8-1 mutant and 35S∶HA-AtOFP8 transgenic plants

A.對照組；B.200 mmol/L甘露醇試驗組； C.300 mmol/L甘露醇試驗組。圖3同。 A.Control group; B.200 mmol/L mannitol experimental group; C.300 mmol/L mannitol experimental group.The same as Fig.3.

2.2.2 綠葉率 植物葉片對干旱脅迫十分敏感，輕度干旱脅迫就會使植株葉片發生性狀變化。在對照組中，Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株綠葉率無顯著差異，且在7 d時綠葉率均為100%(圖3-A)；在200 mmol/L甘露醇處理9 d時，35S∶HA-AtOFP8和Col植株綠葉率均為100%，Atofp8-1植株綠葉率為84%(圖3-B)；在300 mmol/L甘露醇處理11 d時，35S∶HA-AtOFP8植株綠葉率為54%，Col植株綠葉率為24%，但Atofp8-1植株綠葉率只有12%(圖3-C)。

圖3 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8 植株在不同濃度甘露醇處理下的綠葉率Fig.3 Green leaf rate of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant treated with different concentrations of mannitol

2.2.3 表型 當植物遭受干旱脅迫時，葉片會出現下垂的表型，抗旱性較強的植株，葉片下垂程度較輕，葉片中相對含水量更高。對Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株同時停止澆水18 d，觀察植株在干旱脅迫下的變化(圖4)，3種擬南芥植株的表型差異十分明顯，其中，Atofp8-1植株葉片萎蔫十分嚴重，而且部分植株干枯，葉片發黃細小；Col植株葉片也出現萎蔫的性狀，多數葉片發生卷曲，但少量葉片黃化；35S∶HA-AtOFP8植株葉片只有輕度萎蔫，少數葉片發生卷曲，葉片黃化程度低于Col植株。說明35S∶HA-AtOFP8植株的抗干旱能力最強。

圖4 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株在干旱脅迫下生長情況Fig.4 Growth of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant under drought stress

2.3 AtOFP8對干旱脅迫下植株MDA含量的影響

植物在受到干旱脅迫時，植株體內的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)含量會上升，使細胞脂膜受到過氧化作用而形成MDA，破壞細胞膜結構，因此，經常用MDA的含量代表脂膜的過氧化程度[18]。如圖5所示，干旱處理5 d時，與對照組相比，Atofp8-1植株葉片中MDA的含量(以鮮質量計)顯著增加了60.3%，而Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中的MDA含量與對照組中的MDA含量無顯著差異，說明此時干旱脅迫還未對Col和35S∶HA-AtOFP8植株的細胞脂膜造成過氧化傷害。干旱處理10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中MDA的含量分別較對照顯著升高了103.4%，67.8%和36.9%，說明此時干旱脅迫對植株細胞膜脂產生過氧化傷害，與Col植株相比，Atofp8-1植株的細胞膜受損更嚴重，35S∶HA-AtOFP8植株受損最小，但Col、Atofp8-1、35S∶HA-AtOFP8之間差異均未達顯著水平。干旱脅迫15 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中MDA的含量分別較對照顯著升高了229.8%，130.4%和71.1%，且35S∶HA-AtOFP8與Col和Atofp8-1差異顯著，表明過表達AtOFP8基因能夠減輕干旱脅迫對擬南芥植株造成的過氧化損傷。

相同字母表示不具有顯著差異(P>0.05);不同字母表示具有顯著差異(P<0.05)。圖6-10同。 The same letters indicate no significant difference(P>0.05)；Different letters indicate significant difference(P<0.05).The same as Fig.6-10.

2.4 AtOFP8對干旱脅迫下植株抗氧化酶活性的影響

2.4.1 SOD活性 植物體內的抗氧化酶系統，能夠保護植物細胞脂膜免受過氧化作用的傷害，植物體中的抗氧化酶包括SOD和POD。SOD 是植物細胞中廣泛分布的一類金屬酶,它組成了植物細胞內第一條抗氧化系統的防線, 在干旱脅迫下植物細胞內SOD 活性與其抗氧化能力呈正相關[19]。如圖6所示，干旱脅迫5 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中SOD的含量(以鮮質量計)分別較對照升高了10.9%，21.4%和27.6%；干旱脅迫10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中SOD的含量分別較對照升高了19.6%，62.5%和76.4%；干旱脅迫15 d時，Atofp8-1突變體、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中SOD的含量分別較對照升高了16.3%，47.0%和67.3%。

圖6 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株在干旱脅迫下的SOD活性Fig.6 SOD activity of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant under drought stress

2.4.2 POD活性 POD在植物正常生長和應激反應中發揮著重要作用，是植物體內重要的保護酶類。如圖7所示，干旱脅迫5 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中POD的含量(以鮮質量計)分別較對照升高了18.5%，32.5%和38.3%; 干旱處理10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中POD的含量分別較對照升高了48.5%，79.5%和181.1%; 干旱處理15 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中POD的含量分別較對照升高了30.1%，44.0%和86.2%。

圖7 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株在干旱脅迫下的POD活性Fig.7 POD activity of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant under drought stress

2.5 AtOFP8對干旱脅迫下植株滲透調節物質含量的影響

2.5.1 脯氨酸含量 滲透調節是植物適應干旱脅迫的重要生理機制，干旱脅迫會引起植物脫水造成滲透脅迫，植物通過大量合成和積累滲透保護劑來緩解干旱脅迫，降低水分的流失，大量研究表明，可溶性蛋白和脯氨酸是重要的滲透調節物質[20]。如圖8所示，在對照組中，Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中脯氨酸含量(以鮮質量計)無顯著差異；干旱處理10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中脯氨酸的含量分別較對照升高40.0%，87.8%和242.6%，且35S∶HA-AtOFP8與Col和Atofp8-1差異顯著，表明AtOFP8能增加干旱脅迫下的擬南芥葉片中游離脯氨酸的積累，降低水分的流失。

2.5.2 可溶性蛋白含量 如圖9所示，干旱處理10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中可溶性蛋白的含量(以鮮質量計)分別較對照升高了29.6%，40.1%和67.4%，且35S∶HA-AtOFP8與Col和Atofp8-1差異顯著，表明35S∶HA-AtOFP8植株在受到滲透脅迫時，其應變能力要強于Atofp8-1和Col植株。

2.6 AtOFP8植株體內干旱應答基因表達的影響

對Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株干旱應答基因的表達量進行檢測，如圖10所示，在對照組中，與Col植株相比，35S∶HA-AtOFP8植株中的AtRD26和AtRDUF2基因的表達量均顯著升高，但在Atofp8-1植株中的AtADH1和AtERD7基因的表達量顯著降低。在干旱處理10 d時，與對照組處理10 d時的植株相比，Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中AtADH1、AtRD26、AtRDUF2、AtERD7基因的表達量均顯著升高，在Atofp8-1植株葉片中只有AtADH1、AtRD26、AtERD7基因的表達量顯著升高，且在35S∶HA-AtOFP8植株葉片中的AtADH1、AtRD26、AtRDUF2基因的表達量最高，在Atofp8-1植株葉片中的AtADH1、AtRD26、AtRDUF2、AtERD7基因的表達量均最低。

圖9 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株 在干旱處理下可溶性蛋白含量Fig.9 Soluble protein content of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant under drought stress

圖10 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株體內干旱應答基因的表達Fig.10 Expression of drought response genes in Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant

3 討論

當植物遭受干旱脅迫時，首先植株的外部性狀會發生變化。干旱脅迫也能對植物的種子萌發產生抑制[21]。研究表明，高質量分數的聚乙二醇會降低黃秋葵(Abelmoschusesculentus)的種子萌發率，并且黃秋葵種子萌發率會隨聚乙二醇質量分數的升高而降低[22]。干旱對小麥(Triticumaestivum)種子萌發也具有顯著的抑制作用[23]。本試驗結果發現，隨著甘露醇濃度的升高和干旱處理時間的延長，擬南芥植株的萌發率均越來越低，這與前人的研究結果一致[23]，但在干旱脅迫條件下擬南芥植株的萌發率始終是35S∶HA-AtOFP8>Col>Atofp8-1，說明過表達AtOFP8可以提高干旱條件下擬南芥的萌發率。植物葉片是對干旱脅迫十分敏感的器官，干旱脅迫下植物生理生化的變化必然會引起葉片形態的變化，因此，葉片性狀的變化能體現植物對干旱環境的抵抗能力。干旱脅迫使小麥葉片含水量下降，葉片發生卷曲，影響光合作用，干物質分配比例發生變化，植株變矮[24]。在本試驗中，Atofp8-1植株葉片表面蠟質分布比Col植株少，葉片蒸騰速率更快，體內水分散失嚴重，35S∶HA-AtOFP8的表皮蠟質分布比Col植株更多，具有較強的儲水能力，降低蒸騰速率[8];擬南芥植株的綠葉率為35S∶HA-AtOFP8>Col>Atofp8-1，Atofp8-1植株葉片比Col植株更早地表現出萎蔫癥狀，說明35S∶HA-AtOFP8表現出較強的抗旱性。

干旱脅迫可造成植物體內ROS的產生和積累，ROS的產生可能是植物細胞在非生物脅迫下最早的反應之一[25-26]。干旱脅迫引起的植物傷害與ROS傷害有關，而植物體往往通過提高自身SOD、POD抗氧化酶的活性來清除因逆境脅迫而產生的大量自由基，以增強其抗逆性[27]。植物在逆境脅迫中生成的MDA是細胞膜脂過氧化作用的產物之一[18]。滲透調節是植物適應干旱脅迫的重要調節機制，植物通過主動積累滲透調節物質，如脯氨酸和可溶性蛋白來緩解干旱脅迫[28]。綜合分析比較本試驗中擬南芥植株在干旱脅迫下葉片MDA含量、抗氧化酶活性(SOD和POD)、滲透調節物質(脯氨酸和可溶性蛋白)含量，35S∶HA-AtOFP8植株對干旱脅迫的適應性最強。首先，在同一時間和相同濃度的甘露醇處理條件下，35S∶HA-AtOFP8植株在干旱脅迫下葉片MDA含量最低，說明35S∶HA-AtOFP8植株細胞膜透性損傷最小，并且在35S∶HA-AtOFP8植株葉片中抗氧化酶(SOD和POD)活性積累最高，抗旱性強的植物具有較高的抗氧化酶活性，進一步研究發現，在35S∶HA-AtOFP8植株葉片中滲透調節物質(脯氨酸和可溶性蛋白)含量最高，脯氨酸和可溶性蛋白作為滲透調節物質，可以提高細胞液濃度，使細胞液與膜外環境滲透平衡。在相同干旱處理條件下，與Col植株相比，Atofp8-1植株葉片中的MDA含量更高，抗氧化酶活性(SOD和POD)、滲透調節物質(脯氨酸和可溶性蛋白)含量積累更少，說明Atofp8-1植株對干旱的適應性更低。

植物體內的轉錄因子在轉錄水平調控脅迫相關基因的表達進而參與調控植物的抗逆反應[29]。擬南芥乙醇脫氫酶基因(AtADH1)，參與干旱、鹽脅迫和低溫脅迫的過程，干旱脅迫誘導AtADH1基因的表達從而提高擬南芥的抗旱性[30]。AtRD26基因cDNA編碼一個 NAC轉錄因子，轉AtRD26基因的煙草能夠提高對干旱和鹽脅迫的耐受性[31]。和野生型擬南芥相比，AtRDUF2的突變體表現出對ABA途徑敏感性降低的表型，并且顯著降低了對干旱脅迫的耐受性[32]。在擬南芥中，早期脫水脅迫可強烈誘導AtERD7基因的表達[33]。本試驗研究發現，在對照組和干旱處理組中，在擬南芥中過量表達AtOFP8基因均能使干旱應答基因的表達量顯著上升。

綜上所述，隨著甘露醇濃度的增加以及干旱處理時間的延長，Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP83種擬南芥植株受到不同程度的干旱脅迫損傷。35S∶HA-AtOFP8植株在生理調控方面具有較強的協調能力以及較強的保水能力，具體表現在MDA含量最低、抗酶活性(SOD、POD)最高、滲透調節物質(脯氨酸和可溶性蛋白)含量最多，顯著促進干旱應答基因(AtADH1、AtRD26、AtRDUF2、AtERD7)的表達，Atofp8-1植株則表現相反。由此可見，過量表達AtOFP8使擬南芥對干旱的適應性提高，可為擬南芥抗旱培養提供一定的依據。