種植植物對煤矸石填埋區復墾土壤真菌多樣性及養分含量的影響

靳東升，張 強，張變華,2，郜春花，李建華，盧晉晶

(1.山西農業大學 資源環境學院，山西 太原 030031；2. 忻州師范學院，山西 忻州 034000)

土壤真菌是土壤微生物的主要組成部分，對土壤礦物質的分解、養分循環與能量流動具有重要的作用[1]，其多樣性既是評價土壤生態系統平衡的重要指標[2-3]，也是評價土壤肥力高低的敏感性指標，影響著地上植物的生長、農田生態系統功能的調節及土壤健康[4-5]。真菌對環境具有敏感性[6]，有研究發現，土壤真菌多樣性與生境如土壤條件(溫度、濕度、容重、土壤養分、pH值等)、植物種類、耕作方式等密切相關。Yang等[7]研究發現，影響我國黃土高原土壤真菌多樣性的關鍵因素是土壤有機碳和植物豐富度，而影響青藏高原天然草地土壤真菌多樣性的主要因子是植物多樣性[8]。Li等[9]研究發現，在可耕地土壤中，真菌群落結構受到有效磷、有機碳和容重的顯著影響。丁建莉[10]研究發現，黑土中速效鉀、硝態氮和速效磷是改變黑土土壤真菌群落結構的主要環境因子。Wang等[11]研究發現，在采用免耕的系統中，真菌多樣性增加。Dong等[12]研究發現，真菌多樣性無變化。可見，不同的土壤條件、土地利用強度和持續時間、氣候條件、植物覆蓋或其他因素均可能造成土壤真菌多樣性的差異。

礦區復墾土壤通常具有土壤有機質含量低、團聚體少、微生物活性差的特征[13-15]，已有眾多學者對不同植物種植下礦區復墾土壤理化特性、微生物區系進行了研究。金志南等[16]研究發現，在礦區種植豆科綠肥牧草相較于糧食作物更有利于提高復墾土壤有機質、全氮、速效磷、有效鉀含量，加速生土熟化，改善生態環境。洪堅平等[17]對煤矸石風化物進行復墾種植試驗后發現，種植綠肥牧草，有助于提高煤矸石風化物中氮、磷、鉀等養分含量，增加復墾土壤微生物數量。王尚義等[18]研究發現，紫穗槐-高羊茅-紫花苜蓿模式有利于矸石山土壤堿解氮的積累；高羊茅-紫花苜蓿模式對土壤速效鉀和有機質的改良效果最佳；紫花苜蓿蓋度與土壤中的堿解氮、速效鉀和有機質含量呈顯著正相關。但是目前，煤矸石填埋區復墾土壤真菌多樣性對不同植物的響應機制如何目前尚不明確。

本研究主要以山西省古交市屯蘭礦區煤矸石填埋區為研究對象，利用高通量測序技術分析復墾土壤真菌多樣性對不同植物的響應特征，以期為未來的礦區復墾與生態重建工作提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗區概況

試驗區位于山西省古交市屯蘭礦區。該區于2014年復墾為農田，年平均氣溫約9.5 ℃；年平均降水量約460 mm，降水量大多集中在7，8月；無霜期約105 d，為溫帶大陸性氣候。2018年5月在試驗區種植不同鄉土作物與綠肥植物，分別為玉米(Maize， M)、大豆(Soybean， S)、毛苕子(Hair-vetch， H)、苜蓿(Alfalfa，A)及自然恢復(Natural restoration，NR)。依據復墾區域面積，種植大豆、苜蓿各0.033 hm2，毛苕子0.066 hm2，玉米0.20 hm2，自然恢復區0.20 hm2，種植前所有種植區均進行有機無機肥配施，有機肥中有機質含量為53.48%，氮含量為2.2%，無機肥中養分含量為N∶P2O5∶K2O=18%∶12%∶10%，有機肥與無機肥均按照等氮量75 kg/hm2人工撒播施入；株距×行距為30 cm×55 cm；苜蓿、毛苕子均按照地壟撒播。

1.2 試驗材料

供試玉米品種為金蘋618，大豆品種為晉豆21。

1.3 土樣采集

于2018年9月26日在作物收獲后，利用土鉆按照對角線法采集不同植物種植下0～20 cm的復墾土壤樣品。每個處理3次重復，將采集的土樣混合均勻，放入滅菌袋，密封后(4 ℃保溫箱)帶回室內進行養分與微生物試驗；同時，未能及時進行微生物培養試驗的土樣放在-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 測定項目及方法

土壤有機質、全氮、全磷、堿解氮、速效磷和有效鉀含量，參照文獻[19]進行測定。高通量測序是由上海派森諾生物公司對礦區復墾土壤進行微生物組DNA提取，目標片段PCR擴增、產物回收純化、熒光定量等，利用MiSeq測序儀對不同植物種植下礦區復墾土壤真菌的可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit， OTU)進行測定。

1.5 數據處理

采用SPSS 23.0對土壤養分、Alpha多樣性指數進行方差分析；利用Canoco 5.0軟件對土壤真菌屬與養分進行RDA冗余分析；利用R軟件對土壤真菌群落進行Lefse分析。

2 結果與分析

2.1 不同植物種植下復墾土壤真菌OTU單元分析

從圖1可以看出，不同植物種植下復墾土壤中共有的OTU單元數量為67個；特有的OTU單元，大豆地最多，為227個；苜蓿地最少，為136個。 種植植物后土壤中OTU單元數量為514～732個，其中種植大豆后復墾土壤中OTU單元總量最多，為732個；而自然恢復下最少，僅為439個。

2.2 不同植物種植下土壤真菌門、屬特征分析

從圖2 可以看出，煤矸石填埋區復墾土壤中真菌門主要有子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、絲足蟲類(Cercozoa)、纖毛門(Ciliophora)、球囊菌門 (Glomeromycota)、隱真菌門(Rozellomycota)和Anthophyta。其中，相對豐度大于5%的真菌門主要有子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)。不同復墾區土壤中，子囊菌門在自然恢復下相對豐度最小，為36%，而在種植玉米、大豆、苜蓿和毛苕子后其相對豐度均在65%以上，且以種植毛苕子處理增幅最大；接合菌門在自然恢復下相對豐度最大，種植植物后降低了接合菌門的相對豐度，且以種植毛苕子后降幅最大，種植玉米降幅最小；種植毛苕子后土壤中擔子菌門相對豐度最小。

圖1 不同植物種植下復墾土壤真菌OTU單元關系Fig.1 Relation of OTU in reclaimed soil fungi under different plants

圖2 不同植物種植下復墾土壤真菌門特征Fig.2 Characteristics of fungi phylum in reclaimed soil under different plant cultivation

從圖3 可以看出，煤矸石填埋區復墾土壤中相對豐度較高的前20種屬分別為被孢霉屬(Mortierella)、角單菌屬(Ceratobasiduim)、赤霉屬(Gibberella)、腐質霉屬(Humicola)、短梗霉屬(Aureobasidium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、鐮孢菌屬(Fusarium)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、念珠菌屬(Candida)、枝頂孢霉屬(Acremonium)、根霉屬(Rhizopus)、毛殼屬(Chaetomium)、布勒擲孢酵母屬(Bullera)、Olpidiaster屬、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、光黑殼屬(Preussia)、塊菌屬(Tuber)、囊根壺菌屬(Rhizophlyctis)、Knufia。其中，被孢霉屬的相對豐度均大于8%，且自然恢復下其相對豐度最大，為33.6%。人工種植植物降低了其豐度值，種植玉米相對豐度為20.9%，相對于自然恢復降幅最小，苜蓿相對豐度為8.38%，降幅最大。

圖3 不同植物種植下復墾土壤真菌屬特征Fig.3 Characteristics of fungi genera in reclaimed soil under different plant cultivation

2.3 不同植物種植下土壤真菌Alpha多樣性分析

從表1可以看出，不同植物種植下土壤真菌多樣性指標Simpson指數、Shannon指數、ACE指數與Chao1指數均值均大于自然恢復。對于Simpson指數，種植大豆后最大，且自然恢復與不同植物種植間差異顯著(P<0.05)；Shannon指數在種植大豆和玉米后較大，二者差異不顯著，但均顯著高于自然恢復(P<0.05)；Chao1指數與ACE指數均為種植毛苕子后最大，與種植玉米和大豆處理不顯著，但均顯著高于自然恢復(P<0.05)。說明相對于自然恢復，種植植物可以增加煤矸石填埋區復墾土壤中的真菌多樣性。

表1 不同植物種植下復墾土壤中真菌多樣性指數分析Tab.1 α-diversity index of fungi in reclaimed soil under different plant cultivation

2.4 不同植物種植下土壤真菌Beta多樣性分析

本研究采用NMDS分析(Nonmetric Multidimensional Scaling)不同植物種植下土壤真菌Beta多樣性。NMDS是通過降維處理簡化數據結構，在新的低維坐標系中對樣本重新排序，從而在特定距離尺度下描述樣本的分布特征。該分析不受樣本距離數值的影響，僅考慮彼此之間的大小關系，排序結果穩定。

從圖4可以看出，NMDS1、NMDS2將自然恢復與植物種植相分離，自然恢復位于第1象限，玉米與大豆位于第2象限，毛苕子位于第3象限，苜蓿位于第4象限。說明4種不同植物種植中，種植大豆與玉米間差異不顯著，但與毛苕子、苜蓿間差異顯著；自然恢復與植物種植對煤矸石填埋區復墾土壤真菌組成及多樣性影響達顯著水平。

圖4 不同植物種植下復墾土壤真菌NMDS分析Fig.4 NMDS analysis of fungi in reclaimed soil under different plant cultivation

2.5 不同植物種植下土壤真菌多樣性Lefse差異分析

從圖5可以看出，不同植物種植下土壤中差異顯著的真菌26種，包括1個綱，7個目，11個科，7個屬；其中，差異顯著的綱為子囊菌綱(Sordariomycetes)，存在于種植大豆后復墾土壤中；差異顯著的屬在自然恢復土壤中包括被孢霉屬(Mortierella)、漆斑菌屬(Myrothecium)、埋核盤菌屬(Pyrenopeziza) 3種，種植大豆后土壤中包括腐質霉屬(Humicola)和糞盤菌屬(Ascobolus)2種，種植玉米后土壤中有假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus) 1種，種植苜蓿后土壤中有支頂孢霉屬(Acremonium)1種。

圖5 不同植物種植下復墾土壤真菌分類單元差異Fig.5 Difference of fungal taxa in reclaimed soil under different plant cultivation

2.6 土壤真菌豐度與土壤養分含量RDA分析

從表2可以看出，不同植物種植下復墾土壤養分含量不同，除全鉀、全磷外，土壤中養分均為自然恢復最低；不同植物種植下土壤中全氮、有機質和堿解氮含量間存在顯著差異(P<0.05)，均為自然恢復最低，毛苕子下最高。

表2 不同植物種植下復墾土壤養分Tab.2 Nutrients of reclaimed soil under different plant cultivation

利用Canoco軟件對土壤中前50種真菌屬豐度與土壤養分含量進行RDA分析。從圖6、表3可以看出，RDA1與RDA2分別可以解釋33.7%，9.54%，土壤真菌屬的相對豐度受到土壤中全氮、堿解氮和全磷的影響顯著，全氮、堿解氮和全磷的貢獻率分別為38.6%，17.9%，14.6%。

表3 真菌屬豐度與土壤養分含量的RDA分析結果Tab.3 RDA results of fungi abundance and soil nutrient content

圖6 不同植物種植下復墾土壤真菌RDA分析Fig.6 RDA of reclaimed soil under different plant cultivation

3 結論與討論

3.1 討論

3.1.1 種植植物影響復墾土壤真菌多樣性分析 土壤真菌數量巨大，種類繁多，是評價土壤質量變化、土壤生態系統等功能方面有著重要作用[20]。微生物多樣性指數是評價土壤微生物群落多樣性的有效方法，多樣性指數高表明微生物群落多樣性就高[21]。劉淑霞等[22]研究表明，土壤擾動和施肥能降低土壤真菌的多樣性。而本研究發現，自然恢復下土壤真菌多樣性指數最低，種植不同作物下的土壤真菌多樣性較高，說明種植植物可以促進復墾土壤真菌的生長，有利于改善復墾土壤真菌多樣性。同時，結果也表明，種植毛苕子下的Chao1指數與ACE指數較高，大豆下的Shannon指數與Simpson指數較高，該結果與Liu等[23]的研究結果類似。 原因可能是由于不同作物的根系分泌物不同[24-27]，從而引起其土壤真菌微生物的物種多樣性與豐富度指數產生差異，導致土壤真菌群落結構不同，真菌功能多樣性發生變化。

3.1.2 植物種類影響復墾土壤群落結構分析 真菌群落結構對土壤生態系統平衡有重要作用。土壤特性和作物根系分泌物等對真菌群落結構及多樣性的影響較大。本研究表明，不同植物種植下復墾土壤中的真菌差異顯著的真菌綱、目、科、屬共有26種，可能是由于禾本科植物與豆科植物根系不同的分泌物會促生或抑制土壤中某些真菌微生物，進而使不同植物下土壤中的微生物產生差異。子囊菌門大多為腐生菌，是土壤中重要的分解者[28]，可分解難降解的有機質，在養分循環方面起著重要作用[29]。本研究結果表明，復墾土壤中子囊菌門相對豐度最大，為優勢真菌門，在植物種植下占比均達65%以上，遠高于自然恢復下的36%，說明種植植物相較于自然恢復有利于有益真菌門(子囊菌門)的增加。本研究中，被孢霉屬的含量均大于8%，為該復墾土壤中的優勢屬。被孢霉屬是一種具有較強分解纖維素能力的真菌，且接合菌門類下的被孢霉屬為對土壤有益的微生物[30]。本研究中，被孢霉屬均來自接合菌門，且被孢霉屬在自然恢復土壤中占比最大，為33.6%，種植植物后土壤中被孢霉屬豐度降低，種植玉米后土壤中被孢霉屬占20.9%，降幅最小，說明種植植物會抑制該復墾土壤中被孢霉屬的生長。

3.1.3 復墾土壤養分與真菌群落多樣性的關系 土壤養分與真菌群落結構和多樣性有著密切聯系。Hazard等[31]研究表明，土壤有機質等對土壤真菌群落結構會產生重要影響。Bastian 等[32]研究認為，土壤有機質是影響農田土壤真菌群落主要的驅動者。高玉峰等[33]研究表明，土壤堿解氮含量的高低會影響土壤真菌的種類和數量。milauer等[34]研究認為，土壤磷與真菌群落結構或多樣性相關性不大。由此可見，不同學者在不同研究區研究得出的結論有所差異。而本研究通過RDA分析，結果表明，全氮、全磷、堿解氮對復墾土壤真菌群落結構的影響顯著。這可能與試驗區所在地理位置、土壤、氣候等因素有關，具體原因還有待進一步深入研究。

3.2 結論

綜上，煤矸石填埋區復墾土壤真菌多樣性在植物種植與自然恢復間差異較大，植物種植下土壤多樣性指數、豐富度指數均高于自然恢復，植物種植相較于自然恢復提高了土壤中子囊菌門的相對豐度，但降低了被孢霉屬的相對豐度，且不同植物種植下土壤中有不同的優勢真菌屬，土壤中全氮、全磷和堿解氮含量是導致煤矸石填埋區土壤真菌群落結構和多樣性變化的主要驅動因素。