探討金銀花、連翹防治新型冠狀病毒肺炎的網絡藥理學機制※

張 艷,田曉玲,李思思,楊金月,華 川,2

(1.湖北中醫藥大學,湖北 武漢430061;2.湖北省中醫院,湖北 武漢430074)

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19),簡稱新冠肺炎,臨床表現為發熱、咳嗽、氣促、呼吸困難等,可并發嚴重的急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能衰竭,危重者可致死亡[1]。國家中醫藥管理局相繼發布了COVID-19的中醫藥預防方案及臨床診療方案,中醫藥積極參與疫情防控取得了滿意的臨床療效[2]。蔣鵬飛等[2]分析全國各地區COVID-19中醫藥預防方案,發現金銀花的使用頻次最高,且四川省、湖南省、黑龍江省、浙江省、云南省、北京市等地區均有將金銀花、連翹共同使用的預防方藥。研究表明,清熱解毒類中藥具有抗病毒、解熱、抗炎、調節免疫功能等作用,金銀花、連翹提取物能直接通過抑制病毒蛋白的增殖表達而發揮抗病毒的作用[3]。《滇南本草》言金銀花:“清熱,解諸瘡,癰疽發背,丹流瘰疬。”《神農本草經》言連翹:“主寒熱,鼠瘺,瘰疬,癰腫惡瘡,癭瘤,結熱。”研究表明,金銀花含有黃酮類、有機酸類、揮發油類等成分,連翹化學成分包括苯乙醇苷類、木脂素類、萜類和黃酮類等,兩藥配伍具有抗病毒、抗菌、解熱、抗炎等功效[4]。本研究基于中藥網絡藥理學方法,通過構建“中藥-靶點-疾病”互作網絡,闡釋金銀花、連翹通過多成分、多靶點、多途徑發揮清熱解毒、疏散風熱的作用機制,以期為臨床治療COVID-19提供參考。

1 資料與方法

1.1 篩選中藥活性成分 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php,TCMSP)和中草藥有效成分蛋白靶點數據庫(http://lifecenter.biosino.org/hit/,HIT)檢索金銀花、連翹的化學成分,篩選口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18的活性成分。

1.2 預測藥物候選靶點 檢索TCMSP、藥物數據庫(https://www.drugbank.ca/,Drugbank),獲取藥物候選靶點信息。利用歐洲蛋白質信息資源數據庫(https://uniprot.org,UniProt)的uniprot KB搜索功能,規范藥物候選靶點的蛋白名稱,設定篩選物種為“homo sapiens”。

1.3 疾病靶點 通過人類基因數據庫(http://www.genecards.org/,GeneCards數據庫)檢索以“corona virus”“pneumonia”為關鍵詞的 COVID-19靶點。利用uniprot KB搜索功能規范COVID-19靶點的蛋白名稱,設定篩選物種為“homo sapiens”。

1.4 藥物-疾病潛在靶點網絡關系 取藥物活性成分靶點與COVID-19靶點的交集,得到藥物-疾病潛在靶點。將潛在靶點信息導入Cytoscape 3.7.2中繪制“藥物-靶點-疾病”網絡圖。

1.5 蛋白互作網絡構建及生物信息學分析 將藥物候選靶點導入Metascape數據庫(http://metascape.org/)進行蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)分析,設定物種為“homo sapiens”,將蛋白互作結果導入Cytoscape 3.7.2軟件,并繪制PPI網絡,分析網絡拓撲參數,篩選關鍵蛋白靶點,并通過MCODE算法對PPI網絡中的重要模塊進行生物信息學分析。

2 結果

2.1 藥物活性成分候選靶點及疾病相關靶點 利用TCMSP數據庫檢索出金銀花活性成分23個、連翹活性成分23個,其中共有活性成分4個[β-谷甾醇(betasitosterol)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、槲皮素(quercetin)],兩種藥物去重后得到活性成分共42個,見表1。查閱相關文獻補充金銀花、連翹未滿足篩選條件的活性成分4個,分別為綠原酸(chlorogenic acid)、連 翹 酯 苷 A/B(forsythialan A/B)、熊 果 酸(ursolic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)。上述46個活性成分共檢索出518個活性成分靶點,去重后得到214個靶點。見表1。

2.2 藥物-疾病潛在靶點 通過GeneCards數據庫檢索,獲得與COVID-19相關的靶點基因1 150個。將金銀花、連翹的作用靶點與COVID-19的靶點相映射,利用韋恩圖(http://bioinfogp.cnb.es/tools/venny/,venny diagram)得到交集靶點(潛在靶點)59個。見圖1(掃描標題處二維碼,下同)。

2.3 “藥物-靶點-疾病”網絡構建 將金銀花、連翹活性成分與藥物-疾病潛在靶點信息導入Cytoscape 3.7.2,繪制“藥物-靶點-疾病”可視化網絡圖。見圖2。

表1 金銀花、連翹主要活性成分信息

2.4 潛在靶點生物信息分析及PPI網絡構建 ①用DAVID 11.0軟件對59個潛在靶點進行GO功能分析,得到生物過程(biological process,BP)118條、分子功能(molecular function,MF)22條,細胞成分(cell composition,CC)26條。生物過程主要涉及脂多糖介導的信號通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、氧化應激反應(response to hypoxia)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter)、蛋白質寡聚化的正調控(positive regulation of protein oligomerization)、宿主共生體生長的負調控(negative regulation of growth of symbiont in host)等過程;分子功能主要參與細胞外機制(extracellular space)、線粒體(mitochondrion)、過氧化物酶體(peroxisome)等過程;細胞成分主要參與跨膜蛋白結合(identical protein binding)、絲氨酸型內肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)等過程。見圖3。②應用DAVID 11.0數據庫對潛在靶點進行通路分析,并結合相關文獻得到100條相關的信號通路。主要涉及TNF信號通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Fox O 信號通路(Fox O signaling pathway)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)等病理通路,提示金銀花、連翹活性成分可能通過抗炎、調節免疫、解熱止痛、鎮靜等方面防治COVID-19。見圖4。

2.5 潛在靶點的MCODE算法模塊分析 采用Metascape中BioGrid數據庫的PPI和MCODE算法模塊分析功能,得到潛在靶點PPI網絡及3個重要模塊。網絡中共有節點數59個,邊730條,平均節點度24.760,平均局部聚類系數0.751。3個重要模塊共16個靶點(模塊1:AR、RB1、MAPK8、TP53、MAPK1、BCL2,模塊 2:APP、PPARG、JUN、HSPA5、CDK4、MAPK14,模塊3:EGF、GJA1、EGFR、INS)。見圖5。

3 討論

新型冠狀病毒感染人體后存在一定潛伏期,當人體免疫力低下時,病毒入侵呼吸系統,引起一系列炎癥反應,如咳嗽、咯痰、喘息等表現。新型冠狀病毒屬中醫“戾氣”范疇,其病位在肺,主要病機為濕、毒,治療以解毒化濕貫穿始終。目前,新型冠狀病毒的疫苗正在研發階段,中醫預防和治療該病尤為重要[5]。清熱類中藥金銀花、連翹是COVID-19防治的主要中藥,但其作用機制尚未完全清楚。應用網絡藥理學從分子水平預測金銀花、連翹治療疾病的相關靶點和通路等,可為COVID-19研究提供參考。網絡藥理學通過“藥物-靶點-疾病”多層次的網絡構建[6],融合多學科的技術和內容,從整體角度探索中藥與疾病的關聯性,具有整體性、系統性的特點,得到越來越廣泛的認可和應用。研究表明,發熱是COVID-19重要的臨床表現之一,其機制可能與IL(白介素)-1β、IL-6、TNF(腫瘤壞死因子)等內源性致熱原相關[7]。TNF-α是細胞因子網絡中的啟動因子,能誘導其他細胞因子釋放,如IL-6、IL-1β等,共同對組織造成損傷,其中IL-6是造成細胞因子風暴的典型促炎因子[8]。

本研究基于網絡藥理學方法預測金銀花、連翹治療COVID-19的作用機制,獲得金銀花、連翹活性成分46個,主要涉及黃酮類、木脂素類、揮發油類、苯乙醇苷類等,共有活性成分為β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、槲皮素。研究表明,黃酮類化合物,尤其是槲皮素,具有廣泛的活性,具有抗氧化、降血糖、抑制腫瘤等,可應用于治療各種炎癥[9]。木犀草素抗病毒活性體現在對抗登革熱病毒,限制其病毒體的成熟過程,降低毒血癥的發生[10]。金銀花的石油醚、丙酮、乙醇、水提取物均具有抑制流感病毒的作用[11]。連翹脂素可干預TNF-α、IL-6等通路,發揮抗炎抑制作用[12]。連翹富含的木脂素類、苯乙醇苷類及黃酮類等也具有抗炎活性[13]。

金銀花、連翹有效活性成分對應的藥物候選靶點與COVID-19疾病相關靶點映射得到59個潛在靶點。通過進一步的PPI網絡構建與重要模塊子網絡提取,共獲得16個靶點(AR、RB1、MAPK8、TP53、MAPK1、BCL2、APP、PPARG、JUN、HSPA5、CDK4、MAPK14、EGF、GJA1、EGFR、INS)。新型冠狀病毒經過呼吸道侵犯肺部,容易引發肺部缺氧和炎癥反應。研究發現,過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)與炎癥關系密切,可通過促炎基因涉及的反轉錄機制直接轉錄下調影響炎癥反應[14]。EGF、EGFR等表皮生長因子參與細胞增殖,可在VCAM1的黏附作用下促進內皮屏障的重建,改善急性肺損傷[15]。

潛在靶點通路主要涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、Fox O信號通路、T細胞受體信號通路等。研究表明,TNF信號通路中的TNF-α在炎癥反應早期可大量釋放,誘導IL-1、IL-6等促炎因子的產生[16]。PI3K/Akt信號通路參與氧化應激、自噬、炎癥等多種病理活動,影響IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥因子表達[17]。HIF-1信號通路可多途徑調控VEGF、TGF-β1等靶基因的表達,改善氣道炎癥及氣道重塑,緩解咳嗽、咯痰、喘息等癥狀[18]。

綜上所述,在本研究構建的“藥物-靶點-疾病”網絡中,金銀花、連翹通過槲皮素、木犀草素、苯乙醇苷等多種活性成分,作用于TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路等發揮抗炎、調節免疫、解熱止痛、鎮靜等作用。但鑒于網絡藥理學的局限性,后續還需加強實驗設計,并進行實驗證實。