帕金森病小鼠CatWalk 行為學(xué)研究

張子龍,劉思含,姚繼紅,周俊俊

(大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 116044)

帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是繼阿爾茨海默病后第二常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,是由中腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)元變性導(dǎo)致的多巴胺(Dopamin,DA)神經(jīng)遞質(zhì)缺失引起的一種普遍性運動障礙[1]。 隨著PD 的進展,PD 患者的步態(tài)變異性和姿勢不穩(wěn)定性顯著呈現(xiàn)[2],節(jié)律性行走時會受到短步長和低速度的阻礙,這些都與多巴胺水平的降低密切相關(guān)[3]。 常見的帕金森病癥狀包括靜置性震顫,運動遲緩、僵硬,失去姿勢反射等[4],其中步態(tài)紊亂是帕金森病最常見的運動問題之一。 患有PD 的患者通常表現(xiàn)出彎腰姿勢和步態(tài)改變、步幅長度和總體速度減少、雙肢支撐增加、在擺動階段足部間隙減小,以及節(jié)奏變快導(dǎo)致跌倒的可能性增大[5]。 漸進性步態(tài)障礙與姿勢不穩(wěn)定最終往往剝奪了患者的運動能力和日常生活能力[6]。

近年來,為了彌補藥物誘導(dǎo)的行為學(xué)測試方法存在的種種缺陷,滿足日益增長的基礎(chǔ)研究需求,諸多非藥物誘導(dǎo)的行為學(xué)測試方法相繼被應(yīng)用于PD 模型的測試與評價[7]。 其中步態(tài)分析方法已然成為研究PD 嚴(yán)重程度的重要方法[8]。 常用的步態(tài)分析方法包括:評估步行速度、擺動和站立時間的跑步機運動測試[9];評估前肢使用不對稱性的氣瓶測試和評估運動起始狀態(tài)的前肢運動不能測試[10-11];此外,還有曠場測試[12-13]、旋轉(zhuǎn)測試[14-15]、游泳測試[16]和筑巢測試[17]等。 然而,這些測試只能單一測量步態(tài)的動態(tài)或靜態(tài)變化,可觀察到的變化通常較弱。 而且這些測試的指標(biāo)大多應(yīng)用于單側(cè)損傷的動物,因此不足以證明雙側(cè)受傷動物模型的功能缺陷。 而CatWalk 計算機輔助步態(tài)分析系統(tǒng)提供了一種評估步態(tài)功能的自動方法,它可以同時測量大量的動態(tài)和靜態(tài)步態(tài)參數(shù)[18],并且可以檢測出對于嚙齒動物研究特別有價值的肢間協(xié)調(diào)的空間指標(biāo)與時間指標(biāo)。 本研究中我們應(yīng)用CatWalk 步態(tài)分析儀來驗證和評估MPTP 誘導(dǎo)的雙側(cè)病變PD小鼠模型的步態(tài)變異性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6～8 周齡雄性C57BL/6 J 小鼠,20 只,SPF 級,體重22 ～25 g,由大連醫(yī)科大學(xué)SPF 實驗動物中心提供[生產(chǎn)許可證:SCXK (遼) 2013-0003;使用許可證:SYXK (遼) 2013-0006]。 動物實驗經(jīng)大連醫(yī)科大學(xué)倫理委員會同意,并在實驗動物飼養(yǎng)和使用中嚴(yán)格遵守“減少、替代和優(yōu)化”3R 原則給予人道關(guān)懷。 飼養(yǎng)條件:溫度21℃～23℃,相對濕度30%～60%,12 h 照明/黑暗交替的環(huán)境。

1.2 主要試劑與儀器

MPTP,購自美國sigma 公司;CatWalk 小動物步態(tài)分析儀:CatWalk XT,Noldus,荷蘭。

1.3 實驗方法

1.3.1 MPTP 誘導(dǎo)小鼠PD 模型建立

PD 造模方法:將雄性C57BL/6 小鼠隨機分為:空白對照組、MPTP 模型組。 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,每只腹腔注射給予MPTP 30 mg/kg,連續(xù)5 d?？瞻捉M給予相應(yīng)體積的生理鹽水。

1.3.2 動物一般情況監(jiān)測

實驗期間,每天觀察動物一般情況:包括進食、體重等變化。

1.3.3 步態(tài)分析實驗

本實驗用來評價小鼠的自然運動行為及運動協(xié)調(diào)性。 采用小動物步態(tài)分析儀(CatWalk XT,Noldus,荷蘭)檢測,實驗前訓(xùn)練3 d。 檢測時使小鼠自由穿過設(shè)定長度的檢測通道,利用內(nèi)光源腳印折射技術(shù)對攝像頭拍攝視頻中的足印進行高效的計算機處理,在自然行走情況下評估小鼠運動情況。此過程全部在暗室環(huán)境內(nèi)完成,每只小鼠至少接受三次檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0 軟件(SPSS Inc.,Chicago,USA)分析數(shù)據(jù)。 所有數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ±s)。 兩組間比較采用t 檢驗。 P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CatWalk 采集小鼠步態(tài)圖形變化

為了評價MPTP 誘導(dǎo)PD 模型損傷后小鼠運動協(xié)調(diào)性變化,我們應(yīng)用CatWalk 系統(tǒng)檢測了小鼠步態(tài)變化,捕獲大量代表性動態(tài)視頻和圖片(圖1)。從圖中我們可以看出,空白對照組小鼠腳步以交替型為主,且步幅大小均一、步數(shù)穩(wěn)定;MPTP 模型組小鼠腳步模式混亂、步態(tài)紊亂異常、步幅大小不一,三點支撐的增加明顯。

2.2 CatWalk 步態(tài)參數(shù)測定結(jié)果

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn):模型組與空白對照組相比,通過某特定距離的時間(run duration)、最大速率變化(maximum variation)、支撐相時間(stance)、腳步周期(step cycle)顯著增加,平均速度(average speed)、單位時間腳步數(shù)(cadence)、 擺動速度(swing speed)、步幅(stride length)顯著降低(圖2、圖3)。上述8 項指標(biāo)變化差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 小鼠步態(tài)變化對比結(jié)果Figure 1 Comparison of gait changes in mice

圖2 PD 小鼠定量性速度相關(guān)指標(biāo)變化Figure 2 Changes in quantitative speed-related indicators of PD mice

圖3 PD 小鼠定量性爪印指標(biāo)變化Figure 3 Changes in quantitative paw print indicators of PD mice

3 討論

為了對MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠進行更為直觀且無創(chuàng)的行為學(xué)評估,在本實驗過程中引入了CatWalk 動物步態(tài)分析技術(shù)。 實驗結(jié)果顯示,和空白對照組相比,MPTP 誘導(dǎo)的模型組小鼠運動遲緩、運動協(xié)調(diào)能力顯著下降,表現(xiàn)為通過某特定距離的時間(run duration)、 最大速率變化(maximum variation)、支撐相時間(stance)、腳步周期(step cycle)顯著增加,平均速度(average speed)、單位時間腳步數(shù)(cadence)、擺動速度(swing speed)、步幅(stride length)顯著降低。 以上結(jié)果表明,CatWalk動物步態(tài)分析技術(shù)能夠敏銳地捕捉到PD 小鼠的步態(tài)平衡障礙和肢內(nèi)協(xié)調(diào)缺陷。

行動遲緩是PD 的主要行為學(xué)標(biāo)志之一,擺動速度、步幅、腳步周期等都是與移動性分析相關(guān)的參數(shù)。 PD 小鼠模型的步幅和擺動速度明顯降低,可能是由于MPTP 作用誘導(dǎo)小鼠肌肉僵硬和運動功能減退所導(dǎo)致的結(jié)果,這與PD 患者的癥狀基本一致[19],小鼠腳步周期的增大主要是由于爪和玻璃板之間的接觸較長,該參數(shù)的變化也同樣與雙側(cè)6-OHDA 大鼠模型的步態(tài)評估結(jié)果相吻合[20]。 而PD模型小鼠在單位時間腳步數(shù)明顯減少,則是由于小鼠步幅的減少并不能抵消步行周期的增大所致。同時,MPTP 誘導(dǎo)損傷后,還表現(xiàn)出擺動速度降低和支撐相時間的延長。 這些指標(biāo)變化進一步說明了Catwalk 步態(tài)分析參數(shù)可反映PD 小鼠出現(xiàn)步態(tài)紊亂和步態(tài)平衡障礙。

在本項研究中,CatWalk 提供了對MPTP 模型小鼠在運動方面實時、精密且全面的分析,揭示了MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠模型的步態(tài)變化。 相比于其他常用PD 模型檢測方法,如自主活動儀、滾筒法等,CatWalk 的使用更為便捷、檢測數(shù)據(jù)更為可靠、對小鼠的訓(xùn)練更為簡單、且不會對模型小鼠造成任何損傷。 更重要的一點在于CatWalk 系統(tǒng)可以同時、全面地測量步態(tài)的動態(tài)和靜態(tài)相關(guān)參數(shù),并且參數(shù)與PD 行為學(xué)變化有較強的對應(yīng)關(guān)系。 在以PD 為代表的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病動物模型的相關(guān)研究實驗中,CatWalk 檢測系統(tǒng)以其獨特優(yōu)勢,應(yīng)用將會越來越廣。