二乙基亞硝胺聯合四氯化碳誘發C57BL/6 小鼠肝癌模型

仲鑫汝,許 龍,田 睿,蘇 靜,張 勇

(吉林大學基礎醫學院病理生理學系,長春 130000)

肝癌是一種以高發生率、高復發率、高死亡率為特征的侵襲性惡性腫瘤。 在全球范圍內,每年診斷出超過70 萬例肝癌患者,大多數國家死亡率幾乎等于發病率[1]。 2015 年全國腫瘤登記中心數據表明,肝癌發病率呈緩慢下降趨勢,然而,肝癌復發轉移率較高,導致預后較差,肝癌的5 年發病率僅為10.1%,是所有惡性腫瘤中最低的[2-3]。 研究表明,肝癌的主要危險因素包括乙型以及丙型肝炎病毒感染、黃曲霉素攝入、酒精性肝硬化、以及非酒精性脂肪肝等。 肝癌發病隱匿初始癥狀不明顯,初診時只有不到一半的患者處于早期階段,這些患者可通過手術治療(肝切除、肝移植)、TACE、化療和放療等手段治療,其中肝移植是最為有效的治療策略。然而大部分患者確診時已經達到肝癌中晚期階段,由于肝負擔過重等原因,其中的70%患者并不適合手術治療,導致肝癌死亡率居高不下[4-5]。 肝癌的發生是一個多步驟的病理過程,其特征是從慢性肝損傷到肝炎,肝纖維和肝硬化的過程逐漸演變,最終表現為肝癌,然而到目前為止,肝癌的發病機制尚不清楚[6]。 為了探索肝癌的發生機制,尋找有效的治療方法,建立能夠精準模擬人類肝癌發展進程的動物模型就顯得十分必要。

肝癌小鼠模型目前主要分為四種(1)自發性、(2)移植性、(3)化學性、(4)轉基因性肝癌模型,四種模型中化學誘發性肝癌模型因為操作簡單,成瘤率高等原因應用較為廣泛,其中又以DEN 聯合CCl4最為常用。 60 年代以來,遺傳毒性藥物DEN 被廣泛用于肝癌小鼠模型的建立,DEN 作為DNA 烷化劑,可破壞生物體內的DNA、蛋白質、脂質、并且對肝臟的親和力較高,可導致肝細胞死亡,這一過程與肝癌的發生發展十分相似[7]。 近年來發現,DEN(肝癌誘發劑)與CCl4(肝癌促進劑)聯用,可加快肝癌發展,縮短造模時間,降低小鼠的死亡率,提高造模成功率,為后續研究肝癌發生機制奠定了基礎[8]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠110 只,8 周齡,體重為(20±2) g,購于北京維通利華公司實驗動物技術有限公司[SCXK (京) 2017-0033];實驗于吉林大學基礎醫學院動物實驗中心[SYXK (吉) 2018-0001]IVC 獨立送風隔離系統設施中進行;室內溫度為20℃～28℃,相對濕度50%～70%,噪音低于60 dB,光照明暗交替12 h/d;小鼠所食用飼料為吉林大學基礎醫學院動物中心所提供高壓飼料,飲用水為滅菌蒸餾水,使用的籠子等用具均高壓滅菌處理。 在實驗動物飼養和實驗過程中遵循3R 原則(替代、減少、和優化),盡量用無知覺材料替代活體動物、試圖用最少的實驗動物解決實驗問題并減少實驗動物所承受的痛苦,給予實驗動物人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

二乙基亞硝胺(DEN,美國sigma 公司,25 mL/瓶,密度為0.95 g/mL);四氯化碳(CCl4,上海凌峰凌峰化學試劑有限公司,中國);ALT、AST 含量試劑盒(南京建成公司,中國)。 -80℃冰箱(SANYO 公司,日本);天平(METTLER Toledo 公司,瑞士);超速低溫離心機(Beckman 公司,美國); 石蠟切片機(Leica 公司,德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制作方法

根據文獻[9-12]110 只SPF 級雄性C57BL/6 小鼠,預飼養7 d 適應環境后,隨機取30 只小鼠作為正常對照組,其余80 只作為對照組。 正常對照組小鼠無處理,模型組小鼠,腹腔注射DEN(100 mg/kg),間隔2 周,再次注射DEN(50 mg/kg);第一次注射DEN 3 天后給予小鼠CCl4和橄欖油混合液灌胃處理(配置體積比為20 ∶80,劑量為5 mL/kg),每周灌胃2 次,持續進行4 周,灌胃時動作輕柔,以防損傷小鼠食道。

觀察對照組和模型組小鼠生長狀況、精神食欲以及體重等改變情況;按照上述方法造模,分別于給藥后第4、8、12、16、20、24、28、32 周取兩組小鼠的肝組織與眼周靜脈血,對照組每次處死3 只,模型組每次處死6 只。 解剖取小鼠肝左葉,取出的肝組織一部分迅速放入4%多聚甲醛中,組織蛋白質變性凝固,用于組織病理切片,剩余組織放入-80℃和液氮中保存,用于后續實驗;從眼眶靜脈中取靜脈血1.5 mL,靜置24 h,低溫超速離心機以4500 r/min速度(4℃)離心10 min,吸取上清,用于檢測小鼠肝中AST、ALT 含量的變化。

1.3.2 解剖形態觀察和病理學組織觀察

將肝組織從4%多聚甲醛中取出,經過酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋等操作后,將組織切成薄片,黏附于玻片上,蘇木精-伊紅染色后,鏡下觀察小鼠病理組織學結果。

1.4 統計學方法

實驗數據用SPSS 22.0 進行統計分析,所有數據以平均數±標準差(±s)表示。 該實驗所用的圖由使用GraphPad Prism version 6.02 繪制。

2 結果

2.1 小鼠體重變化

110 只小鼠造模前體重為(20±2)g。 與對照組小鼠比較,給藥結束后,模型組小鼠體重明顯下降;隨后的兩個月中,模型組小鼠體重逐漸回升至略低于對照組的水平,隨后的5 個月,模型組體重保持穩定,但始終低于對照組(圖1)。

2.2 小鼠肝臟形態及病理組織學變化

小鼠解剖后,肉眼觀察小鼠肝形態。 對照組小鼠肝質地柔軟,顏色鮮紅,肝表面光滑,未見任何病變。 模型組小鼠給藥8 周時,小鼠肝表面粗糙、色澤暗淡、出現多個大小不一的圓形隆起;第16 周,圓形隆起增多;第24 周,肉眼可見明顯的炎性腫塊和白色腫瘤組織;第32 周,肝布滿白色腫瘤組織,肝組織正常形態基本消失(圖2)。

2.3 病理組織學結果

第6 個月時取對照組和模型組的肝左葉組織,進行HE 染色,隨后在光鏡下觀察,發現與正常的肝組織相比,模型組的炎性腫塊和白色腫瘤組織部位有明顯的癌癥組織病理改變(圖3)。

圖1 對照組和模型組小鼠8 個月體重變化Figure 1 Weight change of the control group and the model group at 8 months

圖2 不同時期小鼠肝臟形態Figure 2 Liver morphology of mice at different times

圖3 小鼠肝組織的病理學改變(HE 染色)Figure 3 Pathological changes of liver tissue in mice. HE staining

2.4 小鼠肝組織中相關酶的變化情況

模型組小鼠的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶相比于正常對照組顯著升高,說明模型組小鼠肝臟受到嚴重損傷(圖4)。

3 討論

2013 年,WHO 宣布由于肝癌導致死亡的人群中50%患者來自中國[13-14]。 由于死亡人數巨大,所以實現肝癌的早期防治,尋找有效且精準的治療迫在眉睫,我們為了觀察肝癌的發生發展的過程,探索肝癌的發生機制,建立能夠精確模擬人類肝癌發展進程的動物模型就成了必要的手段。

目前應用較為廣泛的小鼠模型主要有四種,自發性、化學性、移植性、轉基因性肝癌模型[15-16],自發性肝癌模型是小鼠在未經過任何人工處理下自發形成肝癌,可排除人為因素的干擾,但缺點是造模周期長,成瘤率不穩定,難以監測[17]。 轉基因性肝癌模型是應用基因工程把外源基因導入到小鼠基因組內,不但可以從組織器官水平研究,還可以深入到細胞和分子水平,但是造模技術要求高,價格昂貴,且作用比較局限,國內目前較少開展[18]。移植性肝癌模型是將其他動物或人的組織或細胞移植到造模小鼠體內,該模型在臨床應用較多,主要用于抗癌藥物篩選。 化學誘導肝癌模型是通過注射或者經口給藥方式予以小鼠化學品,目前有多種誘癌劑,如二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)、黃曲霉素B1(AflatoxinB1, AFB1)、二甲基氨基偶氮苯(p-dimethylaminoazobenzene,DAB)、 亞氨基偶氮甲苯(o-aminoazotoluene, OAAT)等,肝癌的的發生是一個多步驟的病理過程,其特征是沿著慢性肝損傷到肝炎,肝纖維和肝硬化的過程逐漸演變,臨床病例中70%的肝癌患者與肝硬化有關,肝硬化是肝癌患者中能觀察到的最常見的組織病理學特征,然而,絕大多數小鼠模型在誘癌過程中并未出現肝硬化和肝纖維化,這與人類肝癌的發生過程形成鮮明的對比,研究發現化學誘癌劑二乙基亞硝胺聯合四氯化碳誘發的肝癌遵循肝炎-纖維化-肝癌過程[19-20],比較基因組學表明,二乙基亞硝胺誘導的肝癌小鼠的基因表達與人類肝癌基因表達最為相似,DEN 誘導的肝癌小鼠模型便于觀察肝癌的發生發展過程。

在該實驗中,我們將谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)作為評價肝損傷的指標,ALT 和AST存在于各種細胞中,但肝細胞含量最多,當肝細胞損害時, ALT 和AST 大量入血,導致血清中AST 和ALT 水平升高[21]。 從圖4 和圖5 中我們可以看出,與對照組小鼠相比,從第8 周開始,ALT、AST 水平逐漸升高,說明小鼠肝細胞持續損傷,并且伴隨著ALT、AST 水平的升高,肝組織中炎性腫塊和白色結節增多,肝組織正常形態逐漸消失,最終發展成肝癌。

本實驗中二乙基亞硝胺聯合四氯化碳雖然成功誘發C57BL/6 小鼠肝癌,但是這個模型仍然存在一些問題,一是雖然采用各種方法來加速肝癌的發生,但形成腫瘤的周期仍然很長。 二是肝癌發生發展的分子機制仍不明確,尚需進一步探索。

圖4 模型組小鼠谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的變化情況Figure 4 Changes of ALT and AST in mice in the model group