人參多糖對乙醇誘導的行為敏化小鼠行為學及前額葉皮層ERK/c-fos 通路的影響

盧 夢,王 鑫,王慧玲,魏 琳,周東月,馬林鋒,卞 男,李雪婷,宋 伍,郭 焱

(長春中醫藥大學,長春 130117)

乙醇依賴是一種慢性腦疾病,表現為強迫性的乙醇渴求以及在戒酒期間出現消極情緒狀態。 乙醇依賴的發展受遺傳因素和環境因素雙重因素影響[1]。 長期攝入乙醇導致腦內神經遞質及其受體發生適應性變化,包括GABA 受體、谷氨酸受體、阿片類受體、5-HT3受體以及多巴胺受體等[2-10]。 細胞外調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)與藥物成癮引起的神經適應性、獎賞效應和覓藥行為密切相關[11]。 目前研究發現能夠改善乙醇成癮癥狀的藥物主要包括作用于GABA 受體、阿片受體、甘氨酸轉運體、神經肽受體及磷酸二酯酶類的化合物[12]。

行為敏化是指反復、間斷給予成癮性藥物后,動物對成癮性藥物的行為效應增強。 反復使用精神刺激物被認為會引發與獎賞效應相關神經回路中持續的神經適應性,這些神經適應作用調節了行為敏感性[13]。 因此,行為敏化的獲得和表達可能反映了增加藥物依賴風險的潛在機制,也是目前評價藥物精神依賴的重要模型。

人參(Panax ginsengC. A. Mey.)作為藥物使用最早記錄在2000 多年前的《神農本草經》中。 現代研究發現人參含有多種活性成分,包括人參皂苷、人參多糖、脂溶性成分、氨基酸、維生素、蛋白質、多肽、有機酸以及微量元素等[14]。 人參多糖(ginseng polysaccharides,GSP)具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤、抗高血糖、中樞神經保護作用[15-17]。 目前對人參的研究多集中在人參皂苷,但人參多糖的藥理活性不容忽視,特別是在中樞神經的保護作用。 盡管研究證實了人參多糖的神經保護作用,但對乙醇成癮的研究未見報道。 基于此,本研究通過融合雙瓶飲酒模式和行為敏化模型,評估人參多糖對乙醇誘導的行為敏化小鼠行為學變化及ERK/c-fos 通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級6 周齡雄性KM 小鼠(22±2)g,購于吉林省長春市億斯實驗動物技術有限責任公司[SYXK(吉) 2018-0014],飼養于長春中醫藥大學實驗中心[SCXK(吉)-2018-0007]。 小鼠適應性飼養5 d,期間自由飲水進食,飼養室溫度為(23±2)℃,相對濕度(50±5)%,光照時間12 h(光照)/12 h(黑暗)。本研究涉及實驗動物的處理均符合長春中醫藥大學倫理委員委會的相關規定(審批號:2018011),并在實驗期間按照3R 原則給予實驗動物人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

人參多糖粉末由吉林省中醫中藥研究所提供,制備方法沿用實驗室前期的方法[18]。 人參粉碎,采用水提醇沉法和Sevag 除蛋白法得到人參多糖粗提物,粗提物用2×10-3mol/L NaCl 溶解,上到已用2×10-3mol/L NaCl 平衡的DEAE-T0Y0PAERL 柱上,用上述溶劑洗脫,再用2×10-3mol/L ～2.5×10-1mol/L NaCl 梯度洗脫,得分子量為5.5×103～2.5×104的多糖部分。 無水乙醇(北京化工廠,批號:20180518),多功能小鼠自主活動記錄儀(山東省醫學科學院設備站),OFT-100 開場實驗箱(成都泰盟軟件有限公司,箱底分成5×5 的格子,將中央1/4 的面積定義為中央區域),ERK 抗體(美國Abcam 公司,貨號:54230),p-ERK 抗體(美國Abcam 公司,貨號:192591), c-fos 抗 體(美 國Abcam 公 司, 貨 號:190289),電泳槽(美國Bio-Rad 公司,Sub Cell GT),蛋白轉印槽(美國Bio-Rad 公司,mini-p4),電泳儀(美國Bio-Rad 公司,PowerPac)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、造模及給藥

將80 只小鼠隨機分為五組:空白組、模型組、GSP 低劑量(100 mg/kg)、GSP 中劑量(200 mg/kg)和GSP 高劑量(400 mg/kg),每只小鼠均單籠飼養。參照Blednov,Bahi 等[19-20]的方法并稍作修改建立行為敏化模型。 適應期:先讓小鼠每天接受兩個都盛蒸餾水的水瓶,適應性喂養5 d,每天更換一次水瓶位置。 形成期:除空白組,將其中一瓶水替換為3%的乙醇,另一瓶仍用蒸餾水。 3%的乙醇喂養4 d后按6%,9%,12%的梯度每隔4 d 遞增乙醇濃度。每天更換乙醇和水的位置,避免形成條件位置偏好,并且每天測量乙醇和水的消耗量,計算每天乙醇(g/kg)的消耗量。 模型組和空白組每天灌胃給予生理鹽水,給藥組每天灌胃給予人參多糖溶液,并于給藥后30 min 記錄各組小鼠的自主活動次數。實驗流程見圖1。 轉換期:第21 天將兩個水瓶都裝入蒸餾水,在第21 天上午8:00-12:00 檢測各組小鼠開場實驗,繼續正常飼養4 d。 激發期:將模型組和給藥組其中一瓶水更換為3%乙醇。 模型組和空白組灌胃給與生理鹽水,給藥組給予人參多糖溶液,30 min 后測各組小鼠自主活動,流程見圖1。

1.3.2 自主活動測試

將小鼠單獨置于大鼠飼養籠中,用多功能小鼠自主活動記錄儀記錄小鼠自主活動次數。 在第0～4天,記錄小鼠在12 h 內的自主活動次數;而在第5 ～25 天,每天給與GSP 干預,在30 min 后測試12 h 內小鼠的自主活動次數。

1.3.3 開場實驗

圖1 實驗流程Figure 1 Experimental procedures

在第21 天上午8:00-12:00 進行開場實驗。 先將小鼠放在空曠地區自由探索5 min,之后將小鼠放在OFT-100 開場實驗箱的中心區域,記錄小鼠站立次數和爬格數(以至少三個爪子跨入同一格子內記為1)。 記錄5 min,每次實驗開始前用乙醇擦拭開場實驗箱。

1.3.4 前額葉皮層氧化應激相關因子測定

ELSIA 法檢測前額葉皮層MDA 含量及SOD 和CAT 活力。 取前額葉皮層組織稱重并加入9 倍量生理鹽水,勻漿,3000 r/min 離心10 min,取上清,按照ELISA 試劑盒說明書操作。 采用考馬斯亮藍法在595 nm 處測定并計算樣品中蛋白含量。

1.3.5 前額葉皮層ERK、p-ERK 和c-fos 蛋白表達

采用Western blot 法檢測蛋白表達。 取前額葉皮層組織并加入蛋白裂解液,勻漿,取上清液待用。測定蛋白含量后,取等量蛋白與含巰基乙醇的4×凝膠加樣緩沖液混合并煮沸10 min。 經SDS-PAGE 電泳,轉膜(PVDF 膜),含5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗ERK(1 ∶500 稀釋),p-ERK(1 ∶500 稀釋),c-fos(1 ∶200 稀釋),4℃孵育過夜,洗膜3 次后加入二抗孵育1 h,加入ECL 顯影液顯影。 用Quality-one 軟件分析條帶灰度值。

1.3.6 Real-time PCR 檢測前額葉皮層中ERK,cfos 的mRNA 表達

按照用100 ∶1加入TRIzol 裂解,總RNA 提取按照RNeasy 試劑盒說明書操作。 總RNA 濃度用ND-2000 微量紫外可見分光光度計檢測RNA 的含量,當OD260/OD280＞1.8 時, RNA 純度符合要求。 采用高容量逆轉錄試劑盒進行逆轉錄,應用Power SYBR Green Master Mix 進行PCR 定量,反應參數為95℃3 min,95℃10 s,60℃45 s,共40 個循環。 結果采用相對定量法進行分析[21],用2-ΔΔCT 表示mRNA的相對表達量,引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統計學方法

實驗計量資料均以平均數±標準差( ˉx ±s)表示,采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據統計分析。多組間比較運用單因素方差分析,方差齊采用LSD檢驗,方差不齊則用Dunnett’s 檢驗,P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSP 對乙醇敏化小鼠自主活動的影響

如表2 所示,模型組小鼠經過自由攝取逐漸遞增劑量(3%,6%,9%,12%)的乙醇后,自主活動在d13 后顯著性增加。 經過4 d 不給予乙醇的轉換期,再次3%乙醇激發,模型組第25 天自主活動次數增加至(5312.11±1581.31)次,較空白組顯著升高(P＜0.05),提示乙醇誘導的行為敏化模型建立;與模型組比較,GSP 三個劑量組在激發期的自主活動次數明顯降低(P＜0.05),提示GSP 抑制了乙醇引起的行為敏化表達。

2.2 GSP 對乙醇敏化小鼠乙醇攝取量的影響

如表3 所示,模型組小鼠第25 天攝取3%乙醇(1.87±0.67) mL 顯著高于空白組的(1.25±1.10)mL(P＜0.05);與模型組相比,GSP 三個劑量組乙醇攝取量較模型組明顯降低(P＜0.05),表明GSP 能夠顯著抑制成癮小鼠的乙醇攝取。

2.3 GSP 對乙醇敏化小鼠轉換期開場實驗的影響

如表4 所示,與空白組比較,模型組小鼠在開場實驗的爬格數和站立次數及進入中央次數和中央停留時間均顯著下降(P＜0.05),提示在此模型實驗動物在轉換期出現焦慮樣行為;與模型組比較,GSP三個劑量組組開場實驗的爬格數和站立次數顯著增加,GSP 中、高劑量組進入中央次數及中央停留時間顯著增加(P＜0.05),表明GSP 對乙醇敏化小鼠轉換期出現的焦慮樣行為具有抑制作用。

2.4 GSP 對前額葉皮層MDA、SOD 及CAT 的影響

如表5 所示,與空白組比較,乙醇誘導的行為敏化小鼠前額葉中MDA 含量顯著升高(P＜0.05),SOD和CAT 活性顯著降低(P＜0.05),提示行為敏化模型小鼠前額葉皮層氧化應激水平增高;與模型組比較,GSP 中、高劑量組顯著降低前額葉皮層中MDA 含量(P＜0.05),SOD 和CAT 活力顯著升高(P＜0.05),表明GSP 可能增強了前額葉皮層的抗氧化能力。

表2 GSP 對行為敏化小鼠自主活動的影響( ˉx ±s)Table 2 Effects of GSP on autonomic activity in behavior-sensitive mice

表3 GSP 對行為敏化小鼠乙醇攝取量的影響( ˉx ±s)Table 3 Effects of GSP on ethanol intake in behavior-sensitive mice

表4 GSP 對行為敏化小鼠OFT 爬格數和站立次數及進入中央次數和中央停留時間的影響( ˉx ±s)Table 4 Effects of GSP on OFT crawling and standing times, central entry times,and central residence time in behavior-sensitive mice

表5 GSP 對前額葉皮層MDA、SOD 及CAT 的影響( ˉx ±s)Table 5 Effects of GSP on MDA, SOD, and CAT levels in the prefrontal cortex

2.5 GSP 對前額葉皮層ERK、p-ERK 及c-fos 蛋白表達的影響

如圖2 所示,Western blot 結果發現模型組p-ERK/ERK比值及c-fos 蛋白表達顯著高于空白組。 與模型組比較,GSP 中、高劑量組p-ERK/ERK(P＜0.05)及c-fos 表達量顯著降低(P＜0.05)。 灰度分析統計見表6。

2.6 GSP 對前額葉皮層組織中ERK、C-FOS 的mRNA 表達的影響

如表7 所示,實時定量PCR 實驗結果發現模型組ERK 和C-FOS mRNA 表達顯著高于空白組(P＜0.05)。 與模型組比較,GSP 中、高劑量組ERK 和C-FOS mRNA 表達顯著降低(P＜0.05)。

3 討論

多數研究認為乙醇成癮的機制是中腦邊緣多巴胺系統的獎賞作用,即長期大量飲酒導致獎賞通路結構產生適應性改變[22]。 越來越多的證據表明C-FOS/ERK 信號轉導參與濫用乙醇成癮和復飲[11]。 ERK 激活引起從細胞膜到下游靶標的細胞質和細胞核內的一系列級聯反應,產生直接反應或者造成渴求和復飲行為的持久適應性。 Sanna 等[23]研究發現長期連續給予乙醇后,大鼠不同腦區p-ERK 蛋白表達均下調;而在乙醇戒斷期,多數腦區的ERK 磷酸化水平升高,說明ERK 與乙醇誘導的神經可塑性改變有關。 Bachtell 等[24]在研究乙醇誘導E-W 核c-fos 表達的機制時,乙醇可以顯著上調E-W 核上c-fos 的表達。 另有研究發現,再次暴露于乙醇相關的環境,激活了大鼠基底外側和中央杏仁核中c-fos 的表達,基底外側中c-fos 的表達與c-jun和ERK 的磷酸化水平升高有關[25]。

表6 GSP 對前額葉皮層ERK、p-ERK 及c-fos 蛋白表達的影響( ˉx ±s,%)Table 6 Effects of GSP on expression of ERK, p-ERK and c-fos proteins in the prefrontal cortex

表7 GSP 對肝組織中p-ERK,C-FOS 的mRNA 表達的影響( ˉx ±s)Table 7 Effect of GSP on mRNA expression of p-ERK and C-FOS in liver tissue

圖2 各組小鼠前額葉皮層p-ERK、c-fos 蛋白表達條帶圖Figure 2 Expression bands of p-ERK and c-fos proteins in the prefrontal cortex for each group of mice

人參的活性成分抗藥物成癮研究越來越受到研究者的關注,多數研究集中在人參總皂苷(ginseng total saponin,GTS)在藥物成癮方面的保護作用。 如Kim 等[26]研究發現GTS 能降低尼古丁引起的神經興奮性,并抑制其誘導的伏隔核(NAc)和紋狀體中Fos 蛋白的表達。 相似的是,Lee 等[27]發現野山參水提物能通過下調NAc 中Fos 蛋白的表達和腹側背蓋區(VTA)中的酪氨酸羥化酶的表達抑制嗎啡誘導的自主活動的增加。 此外,GTS 可以顯著降低可卡因誘導的NAc 多巴胺釋放增加,且對可卡因誘導的神經適應性改變有保護作用[28]。 基于近年來對人參多糖的神經保護作用研究的進一步深入,本研究應用兩瓶自由選擇飲酒模式建立行為敏化模型考察人參多糖對乙醇誘導的行為敏化小鼠行為學變化的影響和可能的機制。 實驗結果表明,GSP 連續給藥對乙醇誘導的小鼠行為敏化和乙醇攝取有顯著的抑制作用,并緩解了乙醇戒斷期引起的焦慮相關行為。 長期攝取乙醇可導致中樞氧化應激的增加,堆積的大量活性氧可經相關的信號轉導過程激活ERK 的磷酸化和c-fos 表達上調,從而參與乙醇成癮的神經適應性改變。 本實驗結果表明,GSP 可顯著減少前額葉皮層脂質過氧化產物MDA 的產生,并提高了抗氧化系統SOD 和CAT的活性。 與前期人參皂苷的研究結果相似,本研究也發現人參多糖能夠下調了前額葉皮層c-fos 和ERK 蛋白和mRNA 的表達。

目前,對多糖的吸收問題仍然存在爭議。 雖然有文獻報道多糖可以被吸收, 但是尚缺乏直接的實驗證據[29]。 越來越多的研究發現中藥中的多糖類成分具有調節腸道菌群,維持腸道菌群穩態的作用[30]。 Zhou 等[31]研究發現,人參多糖有助于修復腸道微生物的整體環境,促進人參皂苷的腸道生物轉化。 此外,有研究發現慢性酒精攝取能夠引起人和嚙齒動物腸道內抗炎細菌普氏棲糞桿菌和雙歧桿菌的水平降低以及革蘭氏陰性的變形菌門的細菌豐度增加[32]。 通過調節腸道菌群可能通過恢復腸道屏障功能、減少全身炎癥對治療酒精依賴和減少酒癮復發產生有益作用。 綜上所述,我們推測人參多糖可能通過調節腸道菌群,發揮抗氧化活性抑制p-ERK/c-fos 通路改善乙醇誘導的行為敏化和乙醇消耗。 本研究結果為今后繼續探究人參多糖的神經藥理活性提供實驗依據,并為乙醇成癮提供新的治療藥物。