姜黃素聯合有氧運動對糖尿病肝病變和肝中脂肪酸β 氧化的影響

劉曉晨,張社峰,王改鳳

(1.河南財政金融學院體育系,鄭州 450046; 2.河南省中醫藥研究院附屬醫院內分泌科,鄭州 450004;3.河南省中醫院腦病一區,鄭州 450002)

在過去的50 年中,肥胖的患病率在世界范圍內大規模增加,并且已經成為導致2 型糖尿病發生的重要因素,是一項重大的健康挑戰[1]。 健康的生活方式、低卡路里攝入和增加能量消耗已經成為當下流行的行為干預和預防措施[2]。 姜黃素是一種天然化合物,分離自姜黃屬植物,具有抗炎、降血脂、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等多種作用,并且毒副作用較低[3-6]。 近年來,姜黃素在糖尿病的治療中的作用越來越被人們重視[1,7]。 本研究將通過使用ob/ob 糖尿病小鼠,探究有氧運動聯合姜黃素是否可以更好的糖尿病小鼠的胰島素抵抗和肝的一些列病理變化,并進一步分析有氧運動聯合姜黃素對糖尿病小鼠肝脂質代謝的影響,闡明有氧運動聯合姜黃素改善糖尿病發病的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

32 只ob/ob 糖尿病小鼠和8 只C57/BL6J 小鼠,體重18～20 g,雌雄各半,均為4 周齡,購于南京大學南京生物醫藥研究院[SCXK (蘇) 2015-0001],所有小鼠均飼養于河南省中醫藥大學動物部,飼養在屏障環境中,12 h/12 h 明暗交替環境,自由飲水和進食, 符合倫理學規定, 倫理編號20180910,并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

姜黃素粉,購自Sigma 公司(BCBL0422G);胰島素ELISA 檢測試劑盒購于Abcam 公司;血清TC、TG ELISA 檢測試劑盒購買于南京建成生物工程研究有限公司;CPT-I 抗體購于Abcam 公司。 血糖試紙和血糖儀購于Roche 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

將32 只ob/ob 糖尿病小鼠按不同性別,采用隨機數字表的方法隨機分為糖尿病對照組(ON 組,n=8 只),有氧運動干預組(OA 組,n=8 只),姜黃素干預組(OC 組,n=8 只),有氧運動+姜黃素干預組(OAC 組,n=8 只),另外8 只C57 小鼠作為正常對照組(NC 組)。

1.3.2 實驗干預方法

有氧運動干預: 小鼠每天進行跑臺訓練,持續8周,速度由第1 周的15 m/min 逐漸線性增加至第4周的25 m/min,自第5 周開始保持25 m/min,至第8周實驗結束,每天上午8 點開始,訓練15 min。

姜黃素干預:姜黃素在使用前溶于生理鹽水配成懸溶液,每天上午10 點開始,給予姜黃素50 μg/g,持續8 周。

1.3.3 葡萄糖耐受和胰島素耐受實驗

葡萄糖耐受實驗(glucose tolerance test):實驗小鼠禁食10 h 后,給小鼠腹膜內注射1.5 g/kg 體重的葡萄糖溶液,并在葡萄糖注射后30、60、90、120 min 后,尾靜脈取血并使用血糖儀測量血糖水平。

胰島素耐受試驗(insulin tolerance test):實驗小鼠禁食4 h 后,給小鼠腹膜內注射1.5IU / kg 重組人胰島素,并在注射后30、60、90、120 min 后,尾靜脈取血并使用血糖儀測量血糖水平。

1.3.4 Western blot

肝臟組織樣品使用蛋白裂解液裂解后,取上清進行蛋白定量,之后加上樣buffer 煮沸待用。 配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠,上樣,跑膠,轉膜,封閉,用特異性抗體檢測蛋白條帶。 CPT-I 購于Abcam 公司,GAPDH 購于武漢三鷹公司。

1.3.5 qPCR

使用Qiagen RNA 提取試劑盒提取肝組織RNA, Bio-Rad q-PCR 儀檢測基因表達情況。 采用兩步法PCR 擴增標準程序引物信息見表1。 Stage 1: 預變性引物,采用SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) (TaKaRa) 進行定量PCR 擴增,定量PCR 體系為10 μL: SYBR;mix:5 μL;cDNA 模板:200 ng, 95℃反應30 s; Stage 2: PCR 反應95℃,5 s, 60℃反應34 s; Stage 3:在7500 Real Time PCR system 熒光定量PCR 儀上進行擴增,溶解曲線顯示引物均特異, 用7500 software v2.0.1 (Applied Biosystems)進行分析。

表1 所用qPCR 引物信息Table 1 The primers used in real-time polymerase chain reaction

1.4 統計學方法

本研究中實驗數據均以平均數±標準差( ˉx ±s)來表示,采用SPSS 17.0 對實驗數據進行分析處理,用t 檢驗來分析兩兩計數資料比較,用重復測量方差分析方法來分析重復測量資料,獨立資料之間應用單因素方差分析,P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 有氧運動聯合姜黃素對ob/ob 小鼠空腹血糖和葡萄糖耐受的影響

由圖1A 可以看出,ON 組的空腹血糖水平顯著高于NC 組,經過8 周的實驗干預后,OA 組、OC組和OAC 組相比于ON 組空腹血糖水平都明顯降低,并且OAC 組與NC 組沒有顯著性差異,已經恢復到正常的水平。 接下來為了進一步驗證實驗干預對ob/ob 小鼠對葡糖糖的耐受性,我們進行了葡萄糖耐受實驗。 結果顯示,OA 組、OC 組和OAC組相比于ON 組都增強了對葡萄糖的耐受性,并且OAC 組比OA 組和OC 組對葡萄糖的耐受性更強(圖1B)。

2.2 有氧運動聯合姜黃素對ob/ob 小鼠空腹胰島素水平及胰島素敏感性的影響

經過實驗干預后,胰島素耐受實驗結果顯示OA 組、OC 組和OAC 組相比于ON 組對胰島素更為敏感的同時,OAC 組與NC 組沒有顯著性差異(圖2A),極大的改善了ob/ob 小鼠的胰島素抵抗情況。各組小鼠的空腹胰島素水平也顯示出同樣的結果(圖2B)。

2.3 有氧運動聯合姜黃素對ob/ob 小鼠肝功能的影響

由圖3 可以看出,NC 組小鼠血清中反應肝功能的指標膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)均低于ON組,經過8 周的實驗干預后,OA 組、OC 組和OAC 組血清中的TC 和TG 水平均顯著低于ON 組(圖3A,3B),進一步通過肝HE 染色結果發現,實驗干預明顯減輕了糖尿病小鼠肝的脂肪性病變(圖3C)。

2.4 有氧運動聯合姜黃素對ob/ob 小鼠肝纖維化的影響

圖4 中qPCR 結果顯示,ON 組肝中導致肝纖維化的膠原沉積相關基因的表達顯著高于正常對照NC 組(圖4A ～4C)。 經過8 周的實驗干預后,OA組、OC 組和OAC 組小鼠肝中膠原沉積相關基因的表達顯著低于ON 組,并且OAC 組與NC 組沒有顯著差異,恢復到正常小鼠的水平。

圖1 各組小鼠空腹葡萄糖水平和葡萄糖耐受試驗Figure 1 Fasting glucose level and glucose tolerance test results in each group of mice

圖2 各組小鼠空腹胰島素水平和胰島素耐受試驗Figure 2 Fasting insulin levels and insulin resistance test results in each group of mice

2.5 有氧運動聯合姜黃素對ob/ob 小鼠肝中脂肪酸合成和分解代謝的影響

圖5 中qPCR 結果顯示,肝中脂肪酸合成相關基因的表達檢測結果顯示,經過實驗干預后,肝中脂肪酸的合成并沒有顯著改變(圖5A,5B)。 與NC對照組相比,ON 組肝中脂肪酸β 氧化相關基因的表達顯著降低。 經過實驗干預后,OA 組、OC 組和OAC 組肝中脂肪酸合成相關基因的表達明顯高于ON 組,并且OAC 組與NC 組沒有顯著差異,達到正常水評(圖5C,5D)。 這些實驗結果表明,實驗干預促進了小鼠肝中脂肪酸β 氧化從而改善了ob/ob 小鼠的糖尿病癥狀。

2.6 有氧運動聯合姜黃素對ob/ob 小鼠肝CPT-I表達的影響

圖6 中Western blot 結果顯示,與正常對照NC組相比,ON 組小鼠肝中脂肪酸β 氧化中的限速酶肉堿脂酰轉移酶Ⅰ(carnitine palmityl transferaseⅠ,CPT-I)表達量明顯降低。 經過實驗干預后,OA 組、OC 組和OAC 組肝中乙酰CoA 羧化酶和脂肪酸合成酶含量明顯高于ON 組,并且OAC 組已經降到與正常對照NC 組相同水平。 這些實驗結果表明,實驗干預明顯促進了糖尿病小鼠肝中肉堿脂酰轉移酶Ⅰ的表達,從而促進了小鼠的脂肪酸β 氧化,達到緩解糖尿病的癥狀,并且OAC 組效果最為顯著。

3 討論

近年來,糖尿病的發病逐年上升,已經成為比肩癌癥和心腦血管疾病的慢性疾病[8-9]。 預防和治療糖尿病是一個復雜的過程,“五駕馬車”理論已經讓大量糖尿病患者受益。 目前,糖尿病的預防和治療方面的研究主要以有氧運動以及長期的藥物治療為主。 有氧運動可以促進葡萄糖轉運載體-4 的表達,從而增強骨骼肌對葡萄糖的攝取并減輕胰島素抵抗[10-11]。 有氧運動過程中可以增強能量消耗,促進機體內的脂質分解,并進一步增加外周組織對葡萄糖的攝取和胰島素的分泌[12]。 之前的大量研究結果顯示,肌肉血管內皮生長因子在有氧運動過程中可以增強毛細血管的再生功能,為骨骼肌提供充足的營養,調節機體的新陳代謝,提高線粒體數量和相關酶的活性,提高骨骼肌的耗氧量,此外還對心肺功能和心腦血管功能具有重要的調節作用[13-14]。 姜黃素是提取自姜黃屬植物根莖中的一種有效成分,是一種多酚類化合物。 姜黃素同時具有2 鄰甲基化的酚和β-二酮功能基團,與機體的多種生物學功能緊密相關。 之前對姜黃素的研究大部分關注的是其在抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂以及免疫調節等方面。 最近幾年由于姜黃素天然毒性低、結構清楚,以及對其藥理學研究的不斷深入,逐漸發現其在糖尿病及相關并發癥中的調控作用。

圖3 各組小鼠肝病變情況Figure 3 Liver lesions in mice of each group

圖4 各組小鼠肝臟纖維化結果Figure 4 Results of liver fibrosis in each group of mice

圖5 各組小鼠肝脂肪酸合成和脂肪酸β 氧化情況Figure 5 Results of fatty acid β-synthesis and oxidation in the liver of each group

圖6 各組小鼠肝中CPT-I 表達量Figure 6 The expression of CPT-I in the liver of each group of mice

本研究中使用ob/ob 糖尿病小鼠為研究對象,探討有氧運動聯合姜黃素治療方法對糖尿病小鼠發病情況的影響。 ob/ob 糖尿病小鼠是瘦素缺失的小鼠,自出生6 周后就可表現出肥胖、空腹血糖升高、胰島素抵抗和脂肪肝等癥狀,是2 型糖尿病相關研究中常用的模型小鼠。 在本實驗中,經過8 周的干預后,糖尿病對照ON 組小鼠的空腹血糖水平明顯高于正常對照NC 組,經過有氧運動或姜黃素干預后,葡萄糖耐受和胰島素耐受實驗結果顯示OA組或OAC 組小鼠的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗情況明顯減輕,并且空腹血糖和空腹胰島素水平明顯低于ON 組。 有氧運動聯合姜黃素干預使小鼠的空腹血糖和胰島素恢復到正常水平,并且OAC 組的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗情況也和NC 組沒有明顯差異。

肝作為胰島素發揮功能的主要靶器官,在機體發生胰島素抵抗時會發生脂質代謝的紊亂,導致肝功能受到破壞、甚至發生脂肪肝。 我們通過ELISA檢測小鼠血清中的TC 和TG 發現,經過實驗干預后,這些指標均呈現不同程度的降低,并且以OAC組的下降最為明顯,幾乎達到正常對照NC 組水平。肝HE 染色的結果進一步證實了經過實驗干預后,OAC 組肝脂肪性病變的改善最為明顯。 通過q-PCR 檢測引起肝發生病變的纖維化相關基因的表達發現,經過實驗干預后,OA 組、OC 組和OAC 組均顯著低于ON 組,表明糖尿病小鼠的肝病變得到緩解。 有氧運動可以顯著降低機體的體重以及體脂含量,調節機體的脂質代謝狀態。 脂質的代謝過程非常復雜,涉及到脂肪酸的合成和脂肪酸β 氧化等。 脂質代謝的具體過程是組織中的脂肪酸被脂肪酶水解成甘油單酯和游離脂肪酸,進入機體循環被吸收后,在小腸中重新合成甘油三酯,并進一步形成乳糜微粒,最終由淋巴系統進入血液循環運送到外周組織中的過程。 研究人員發現,經過實驗干預后,糖尿病小鼠肝中脂肪酸合成相關基因FAS 和SCD 的表達并沒有發生改變,ON 組、OA 組、OC 組和OAC 組均顯著高于正常對照NC 組。 但是脂肪酸β 氧化相關基因LCD 和UCP2 的表達在OA 組、OC 組和OAC 組均呈現不同程度的下降,OA 組、OC組顯著低于糖尿病對照NC 組,OAC 組達到正常對照組NC 組水平。 Western blot 實驗結果顯示ON 組糖尿病對照小鼠肝中脂肪酸β 氧化的限速酶CPT-I顯著低于正常對照NC 組,經過實驗干預后,OA 組、OC 組和OAC 組小鼠肝臟中CPT-I 表達明顯上升。因此,本研究發現有氧運動聯合姜黃素治療可以CPT-I 的表達,進而促進脂肪酸的β 氧化,減輕由糖尿病引起的胰島素抵抗、肝纖維化和脂肪肝的一些列病理性變化,有望成為糖尿病的預防和治療的新方法。