白消安對2 型糖尿病KKAy 小鼠外周血細胞及骨髓細胞的影響

黨 女,盧延華,管博文,孟愛民

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100021)

目前,心腦血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤及慢性呼吸系統疾病等慢性非傳染性疾病(noninfectious chronic disease, NCD)成為威脅我國人民健康的主要疾病,其中2 型糖尿病是惡性腫瘤的獨立危險因素之一[1-3]。 2 型糖尿病除了對腫瘤的發生存在促進作用,同時合并2 型糖尿病的惡性腫瘤在發生發展的過程中可能有更多的基因和表觀遺傳變化,導致惡性腫瘤發展演變成為惡性程度更高、進展更快的狀態[4]。

應用以細胞毒為主的抗腫瘤藥(antineoplastic drugs)進行化學治療仍然是腫瘤綜合治療的重要手段之一。 骨髓抑制是腫瘤化療主要毒副作用。 近年來,在小鼠,大鼠和人類中的研究和臨床研究表明,糖尿病可導致骨髓微環境受損,如微血管病變、神經末梢病變和干細胞動員受損等[5-6]。 骨髓造血功能受損也被認為是糖尿病的并發癥之一[7]。 化療藥物的毒副反應也可能與2 型糖尿病并發癥合并,產生嚴重的預后不良。 此外,2 型糖尿病還可能加重化療的毒性[8]。 惡性腫瘤合并2 型糖尿病的患者的化療可能面臨更大挑戰。 由此,我們推測2型糖尿病患者對化療的耐受性及損傷程度可能與非2 型糖尿病患者不同。 本研究利用白消安化療損傷模型來探討化療對2 型糖尿病小鼠和健康小鼠的造血系統損傷的差異。

本課題組目前已成功構建了白消安誘導造血干細胞損傷模型[9]。 我們采用自發性2 型糖尿病動物KK/upj-Ay/J(KKAy)小鼠[10],KKAy小鼠在8周齡時血糖水平顯著升高[10]。 國內外多采用C57小鼠作為KKAy小鼠實驗的對照鼠[11]。 本研究擬建立白消安化療損傷模型,比較KKAy小鼠與對照C57BL/6 J 小鼠造血免疫功能反應性的差異,為臨床相應情況安全用藥提供資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

KK/upj-Ay/J 小鼠(以下簡稱為KKAy小鼠)雄性20 只,SPF 級,10 ～12 周齡,體重28 ～35 g,C57BL/6 J 小鼠(以下簡稱為B6 小鼠)雄性20 只,SPF 級,10～12 周齡,體重25 ～30 g。 兩種小鼠均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[SCXK(京) 2014-0004]。 小鼠飼養于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所屏障環境動物房[SYXK (京)2015-0035]。 動物實驗研究符合動物福利,遵循中國醫學實驗動物研究所制定的實驗動物保護和使用的指南,實驗動物飼養和實驗過程中按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。 實驗方案通過醫學實驗動物研究所實驗動物管理和使用委員會批準(IACUC 號:MAM18002)。

1.2 主要試劑與儀器

白消安(busulfan)購自Sigma-Aldrich;DMSO 購自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑與儀器同參考文獻[12]。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及給藥

將C57BL/6 J 小鼠分為對照組(B6 組)和給藥組(B6 BUS 組),KK/upj-Ay/J 小鼠分為對照組(KKAy組)和給藥組(KKAyBUS 組)。 給藥組小鼠腹腔注射白消安,劑量40 mg/kg,分兩天連續給藥,每次劑量20 mg/kg。 對照組腹腔注射等劑量5%DMSO。 給藥15 d 后取材,檢測相應指標。

1.3.2 外周血細胞計數和分類

白消安給藥后15 d,進行外周血計數及分類檢測[12]。

1.3.3 造血干細胞和造血祖細胞比例測定

實驗操作同參考文獻[12]。

1.3.4 粒細胞巨噬細胞集落形成單位(colonyforming unit-granulocyte and macrophage,CFU-GM)測定

實驗操作同參考文獻[12]。

1.4 統計學方法

計量數據以平均數±標準差( ˉx ±s)表示,采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析,組間差異用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA) 和 Tukey 多 重 比 較 法(Tukey’ s multiple comparison test),重復測量數據采用重復測量數據方差分析方法。 以P ＜0.05 為差異有顯著性。

2 結果

2.1 白消安對小鼠外周血計數和分型的影響

白消安對B6 和KKAy小鼠外周血細胞計數和分類的影響的實驗結果如圖1 所示。 與B6 溶劑對照組相比,KKAy溶劑對照組的WBC、HGB 及LYM%顯著低于B6 小鼠;NEU%顯著高于B6 小鼠,其余指標未見統計學差異。 與B6 溶劑對照組相比,B6 給藥組的WBC、RBC、HGB、PLT、LYM 及NEU 均顯著降低;其中WBC、PLT 和NEU 下降比例較多,分別為40.21%、56.5%和55.4%。 與KKAy溶劑對照組相比,KKAy給藥組的WBC、RBC、PLT、LYM 及NEU 均顯著降低,而HGB 和LYM%有下降趨勢,但無統計學差異;其中WBC、PLT 和NEU 下降比例較多,分別為36.9%、38.8% 和63.7%。KKAy給藥組的WBC、RBC、HGB 以及LYM 明顯低于B6 給藥組,提示在上述4 個指標上,KKAy小鼠的損傷可能更為嚴重。 而KKAy給藥組的PLT 明顯高于B6 給藥組,且給藥后KKAy小鼠的PLT 的下降幅度則明顯低于B6 小鼠,提示在PLT 這一指標上,KKAy小鼠的損傷更輕,且耐受性更高。

2.2 白消安對小鼠造血干細胞和造血祖細胞比例的影響

為探究白消安對KKAy和B6 小鼠的造血系統的影響,我們通過流式細胞術檢測了小鼠骨髓中造血祖細胞HPC、造血干細胞HSC 以及長期造血干細胞LT-HSC 在骨髓細胞中所占比例。

實驗結果如圖2 所示,與B6 溶劑對照組相比,KKAy溶劑對照組的HSC 比例明顯較低。 給藥后,與B6 溶劑對照組相比,B6 給藥組的HPC、HSC、LTHSC 的比例均明顯降低;與KKAy溶劑對照組相比,KKAy給藥組的HPC、HSC、LT-HSC 的比例均明顯降低。 對比變化幅度可發現,給藥后,KKAy小鼠的HPC 下降幅度明顯高于B6 小鼠(P＜0.05),而HSC的變化幅度明顯低于B6 小鼠(P ＜0.05),提示KKAy小鼠在HSC 這一指標上表現出較強的耐受性。

2.3 白消安對小鼠CFU-GM 的影響

CFU-GM 可以反映骨髓中HPC 的增殖能力,實驗結果顯示白消安抑制骨髓中造血祖細胞的功能,顯著降低B6 和KKAy小鼠的CFU-GM,但給藥前后,兩種小鼠者的造血祖細胞功能未見差異(見圖3)。

3 討論

本研究參考課題組之前發表的文獻,采用40 mg/kg 白消安腹腔注射小鼠作為實驗組,5%的DMSO 腹腔注射小鼠作為溶劑對照[10]。 一般認為,雌激素對小鼠放化療損傷有保護作用,因此采用了雄性小鼠研究。

與B6 溶劑對照組相比,KKAy溶劑對照組小鼠的體重明顯較高,WBC、HGB、LYM%明顯較低,NEU%則處于較高水平,骨髓中HSC 的比例明顯較低,脾的B 細胞的比例較高,脾中T 細胞的比例較低。 此結果提示2 型糖尿病KKAy小鼠與B6 小鼠在造血免疫功能上可能存在一定差異。 KKAy小鼠的NEU%明顯高于B6 小鼠。 中性粒細胞從骨髓中動員起來,在急性環境中引發炎癥反應,研究發現NEU 在慢性病如2 型糖尿病中增高,導致慢性持續的炎癥反應[13]。 2 型糖尿病中的長期慢性炎癥狀態可通過多種途徑引起組織損傷,包括活性氧增加、免疫系統持續激活、誘導細胞凋亡和組織微環境改變等[14]。 KKAy小鼠的HSC 在骨髓細胞中的比例明顯低于B6 小鼠,提示KKAy小鼠的造血系統功能可能有損傷。 HSC 受損可能與上述慢性炎癥狀態影響造血微環境有關。

實驗結果可見40 mg/kg 的白消安對小鼠明顯的骨髓抑制作用,說明白消安誘導小鼠骨髓造血系統損傷模型造模成功。

白消安能夠誘導骨髓中分裂旺盛的造血細胞凋亡,并導致不同功能分化階段的血細胞降低外周血象,給藥后,B6 小鼠和KKAy小鼠的WBC 和PLT下降明顯。

一般來說,細胞毒類藥物白消安能夠誘導腫瘤細胞凋亡,主要副作用是造血祖細胞功能受損,當劑量較高時也會損傷造血干細胞功能[10]。 40 mg/kg 的白消安給藥劑量可明顯降低HPC 和HSC 比例,損傷HPC 功能。 白消安給藥后,KKAy小鼠的HSC 的下降比例明顯低于B6 小鼠,其耐受性明顯高于B6 小鼠。 有研究報道小鼠的HSC 對氟尿嘧啶(5-FU)或羥基脲等抗增殖化療藥物表現出耐受性[15],其原因可能在于小鼠體內休眠干細胞(dormant Mouse HSCs,d-HSCs,表型Lin-Sca1+c-Kit+CD150+CD48-CD34-)處于相對靜止即休眠狀態,這一特性被認為可以保護造血干細胞免受功能衰竭和細胞損傷以保持造血細胞終生產生,這一機制可以解釋HSC 對抗增殖化療藥物產生的耐受性[16]。而KKAy小鼠的HSC 對放化療的耐受性更高,可能是KKAy和B6 小鼠的d-HSC 存在差異,從而表現出對放化療較強的耐受性,仍需要進一步研究。

圖2 白消安對小鼠造血干/祖細胞比例的影響Figure 2 Effect of busulfan on percentages of HPC, HSC, and LT-HSC in bone marrow

圖3 白消安對小鼠CFU-GM 的影響Figure 3 Effect of busulfan on CFU-GM of C57 and KKAy mice

白消安給藥后,KKAy小鼠的HPC 的比例下降得更為明顯。 之前研究發現卡鉑能顯著降低2 型糖尿病db/db 小鼠的HPC 功能,卡鉑在db/db 小鼠中骨髓毒性增加[17]。 Geresi 等人[18]發現肥胖的Zucker 大鼠和非肥胖但胰島素抵抗的Goto-Kakizaki大鼠都存在造血祖細胞損傷,提示胰島素抵抗可能影響骨髓造血系統功能,影響化療藥物的骨髓毒性。 此次研究并未檢測KKAy小鼠的糖耐量,但就之前的研究結果來看,KKAy小鼠中存在明顯的胰島素抵抗,這可能與KKAy小鼠對白消安的造血祖細胞損傷耐受性降低有關[18]。

KKAy小鼠是自發性肥胖的2 型糖尿病動物模型,2 型糖尿病會對造血系統造成損傷,肥胖還可能慢性炎癥以及藥物的藥代動力學改變[19]。 在腫瘤治療中,通常不會考慮患者體重等因素。 然而2 型糖尿病患者常伴有肥胖,化療藥物可能在脂肪組織內蓄積而改變藥物的藥代動力學進而影響藥效,另一方面肥胖也可能通過藥效學機制影響化療藥物的骨髓毒性。

惡性腫瘤合并糖尿病的患者愈來愈多,因此需要更多的實驗數據研究惡性腫瘤合并糖尿病患者的耐受性,以便給臨床醫生提供更多的循證醫學證據,給患者帶來更大的受益。 隨著有效化療藥物和治療方案的不斷更新,新的預后評價手段和指標的引進、放療的調整發展,醫生根據病人的個人情況推薦不同的具有針對性的療法,才能給病人帶來治療的最大受益。