經肋間肌穿刺法測定肺動脈高壓小鼠模型右心室壓力

魏瑞奇,樸春梅,張文美,朱光發*

(1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院呼吸與危重癥醫學科,北京 100029;2.首都醫科大學附屬北京安貞醫院北京市心肺血管疾病研究所,北京 100029)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種進行性加重的致命性疾病,其主要特征是肺血管重構和肺血管阻力進行性增高,最終引起右心功能衰竭甚至死亡[1]。 PH 的發生發展過程與肺血管結構和功能異常密切相關,肺血管床內膜損傷、中層肥厚、外膜增殖、纖維化導致肺動脈管腔進行性狹窄、閉塞,肺血管阻力不斷升高,但PH 的發病機制尚未完全闡明[2]。 因此,利用實驗動物建立PH 動物模型在PH 機制研究中必不可少,常用的PH 動物模型實驗動物主要是大鼠和小鼠,其中小鼠由于便于飼養,繁殖能力強,背景清晰,同時目前用于PH 基礎研究的基因工程動物主要是小鼠來源[3],因此小鼠PH 模型制備和應用極其重要。

評估PH 動物模型最主要的指標就是血流動力學的測定,因此建立一個快速、準確的評估肺血管及右心室血流動力學狀態的方法,是目前該領域亟待解決的問題。 研究表明,在沒有肺動脈瓣疾病的情況下,右心室收縮壓可用來評估肺動脈收縮壓的高低[4],目前常用測定方法有主要有經頸外靜脈右心導管術[5-6]、經頸外靜脈導絲引導右心導管法[7]、呼吸機輔助開胸直視下穿刺法[8]、開腹經膈肌穿刺右心室法[9]、經胸壁右心室盲穿法[10]等,這些方法主要應用于大鼠。 小鼠的測定方法主要有開胸法[11]、右心導管法等[12-13]。 相較大鼠而言,小鼠重量僅為大鼠的1/10,血管細,心臟小,右心導管操作困難,成本高且耗時,成功率低[11]。 呼吸機輔助的開胸直視穿刺檢測需要連接呼吸機和氣管插管,且暴露胸腔所造成的人為氣胸改變了小鼠生理狀態下的心臟所處的密閉環境,可能對測定結果產生不可預測的影響。 最近高陽等[14]PH 模型小鼠采用閉胸右心室穿刺法檢測小鼠右心室收縮壓,但未描述具體操作方法和步驟。 本研究旨在采用一種經肋間肌穿刺法測定肺動脈高壓小鼠模型右心室壓力的實驗方法,保持動物胸腔密閉無需呼吸機輔助呼吸,使操作便捷高效,介紹如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 J 小鼠23 只,8～10 周齡,體重(20 ± 3)g,購自北京唯尚立拓科技有限公司[SCXK(京) 2016-0009],低氧組11 只,對照組12 只飼養于北京市心肺血管疾病研究所實驗動物中心SPF級屏障系統內(濕度40%～70%,溫度16℃～26℃)[SYXK (京) 2016-0027]。 本研究實驗方案經北京安貞醫院倫理委員會批準,實驗過程符合實驗動物倫理學要求的3R 原則(減少、替代、優化),并給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

動物低氧艙(加拿大Optoprobe Research 公司)、Power Lab4/30 多導生理儀(ML866,澳大利亞埃德儀器國際貿易有限公司)、Lab Chart 軟件、冷光源(MODEL C-F1230,日本Nikon 公司)、電子天平(JA2003,上海舜宇恒平科學儀器有限公司)、壓力換能器探頭及三通管、0.6 mm×25 mm 一次性輸液器針頭(S2D2S,江西科倫醫療器械制造有限公司)、10 mL 及1 mL 注射器、1%戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)、0.9%生理鹽水、酒精噴壺、自制小鼠固定板、醫用膠帶、眼科鑷、眼科剪、醫用棉球等。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備肺動脈高壓小鼠模型

23 只小鼠進行完全隨機分組,對照組12 只,低氧組11 只。 低氧組小鼠在密閉的低氧艙里飼養4周,誘導形成肺動脈高壓,其中低氧艙內24 h 持續泵入空氣和氮氣的常壓混合氣體,通過氧氣監測控制系統監測,保證低氧艙內氧濃度控制在(10±0.5)%,CO2濃度低于0.5%。 對照組小鼠在正常空氣中飼養4 周,其它條件相同。

1.3.2 測定右心室壓力的步驟

(1)稱重、麻醉及固定:稱重記錄,根據小鼠體重,按照10 μL/g 劑量給小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉溶液(0.9%生理鹽水配制)進行麻醉,待小鼠肌張力消失、刺激無反應時將其四肢用膠帶固定于自制的泡沫塑料鼠板上(圖1-1),注意避免使小鼠四肢過度拉伸,以防止對胸腔壓力產生影響。

(2)實驗儀器調試:多導生理儀連接電腦、壓力換能器探頭及三通管,三通管的另外兩頭接輸液器針頭和裝有肝素生理鹽水的10 mL 注射器,反復調整將肝素生理鹽水充滿整個通道,不要留有氣泡,打開Lab Chart 軟件的RVP 模塊,壓力基線調零。

(3)剪開胸前皮膚:小鼠切口部位用75%酒精消毒(圖1-2),用鑷子將小鼠劍突下的皮膚提起,剪開一小口,沿胸骨正中線將小口直到頸部的皮膚剪開(圖1-3、圖1-4),并在左側肋緣下剪一斜行的切口,提起兩側的皮膚切口,輕輕向兩側撕開,注意動作輕柔,防止皮下血管破裂出血。 此時可以看到小鼠左側胸大肌清晰的暴露出來,大致呈一直角三角形(圖1-5)。

(4)鈍性分離胸肌:用眼科鑷將小鼠胸大肌從下緣游離端緊貼胸骨左緣鈍性分離(圖1-6),分離后鑷子垂直提起胸大肌可見其下覆蓋的胸小肌,右手持鑷輕提提胸小肌內側緣,左手再拿一鑷子鈍性分離胸小肌,并且將胸小肌從下至上撐開(圖1-7)。

(5)暴露左胸壁肋間隙:將鈍性分離好的胸大肌用剪刀沿胸骨附著處剪開并上翻,若有少量滲血,可用棉球擦去,以保持術中視野清晰,同理胸小肌也沿肋弓外下緣剪開并上翻,即可暴露看到小鼠左胸肋骨及肋間隙(圖1-8)。

(6)判斷心臟位置:透過燈光可見第三、四肋間小鼠心臟快速的搏動,可大致判斷出心臟的輪廓,搏動最明顯處為心尖,通常位于第四肋間隙,心尖偏右上方處搏動較心尖處稍弱的部位就是右心室。術者左手大拇指在劍突下向上推擠心臟,同時中指向右輕推胸壁,使心臟緊貼左胸前壁并固定(圖1-9),同時右手持針快速穿刺。

(7)右室穿刺點的確定:通過(6)確定右心室搏動位置后,選擇左側第四肋肋角內側大約1 mm 左右的肋下緣作為進針點,先將針頭垂直于胸壁的方向持針,然后進針方向各向下、向左(以小鼠的體位作為參照方向)傾斜大約15°角后進行穿刺,穿刺深度大約10 mm,可事先用馬克筆在針頭上做好標記。穿過右心室壁時可有明顯的突破感。 針頭成功進入右心室后,可見針管中有回血,隨著心臟的搏動有節律的回吸,同時持針的右手可明顯感受到心室有力的搏動(圖1-10)。 松開擠壓小鼠胸壁的左手,右手固定穿刺針,在Lab Chart 軟件界面可以看到右心室搏動的壓力曲線趨于穩定,記錄一段穩定的右心室壓力波形后拔出針頭。

(8)開胸驗證穿刺點位置:迅速從劍突下向兩側剪開胸廓下的肌肉和組織,剪破膈肌,沿胸骨正中線剪開胸骨,將游離的兩側胸壁向兩側拉開,鑷子剝開心包膜,暴露心臟,用棉球擦去表面積血,仔細觀察可在右心室壁表面看到一個正在滲血的穿刺點(圖1-11、圖1-12),驗證了步驟(7)的針頭成功刺入右心室,得到的波形圖為右心室壓力變化曲線。

(9)實驗數據記錄及數據分析:Lab Chart 軟件上記錄整個過程壓力的變化。 選擇一段平穩的波型(如圖2、圖3),鼠標右鍵選中該段波形,點擊添加到數據板,在數據板中則可查看該段波形的平均右心室收縮壓。

1.3.3 右心室肥厚指數的測定

分離小鼠心臟,剪去心耳和大血管,生理鹽水洗去心腔內殘血,再沿室間隔剪下右心室,用濾紙吸去其水分,用電子天平分別稱量右心室(RV)、左心室+室間隔(LV+S)的質量,最后計算右心室肥厚指數[RVHI=RV/(LV + S)× 100%],作為右室肥大的指標。

1.3.4 肺組織的處理

摘下兩肺,分離出左肺,用0.9%的氯化鈉注射液沖洗干凈,固定于4% (體積分數) 多聚甲醛溶液中24 h,然后依次進行梯度乙醇脫水,石蠟包埋,做4 μm /張的連續切片,進行蘇木素-伊紅染色(HE 染色)和α-平滑肌肌動蛋白免疫組化染色(a-SMA 染色),最后在光鏡下(200 ×)觀察比較肺小動脈形態學變化。

1.4 統計學方法

使用SPSS 22.0 統計學軟件對數據進行分析,實驗數據以平均數±標準差(ˉx±s)來表示,兩組數據采用兩獨立樣本t 檢驗,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

圖1 實驗操作步驟圖Figure 1 Experimental procedure diagram

圖2 正常小鼠的右室壓力曲線圖Figure 2 The RVSP curve of normal mouse

圖3 肺動脈高壓小鼠的右室壓力曲線圖Figure 3 The RVSP curve of pulmonary hypertension mouse

2 結果

2.1 造模4 周后小鼠的一般情況

低氧組小鼠較對照組活動量明顯減少,呼吸急促,毛發無光澤,口唇發紫,進食飲水量也明顯減少,胸壁肌肉發紅發紫。 與對照組相比,低氧組小鼠體重明 顯 降低,[(18.24 ± 2.36) 比(22.62 ±2.87)],差異有顯著性(P＜0.05),結果見表1。

2.2 右室壓力曲線

從小鼠固定到測出右心室壓力曲線,整個過程可在3～4 min 內完成,低氧組11 只小鼠的RVSP 全部測出,對照組12 只小鼠中,有1 只測定失敗,穿刺成功率達95.65%(22/23)。 在推擠胸廓固定心臟穿刺成功的幾秒內,壓力峰值較高且波動較大,術者松手后,峰值略有下降并逐漸平穩,選取該段平穩的壓力曲線得到RVSP 值(圖2、圖3):穩定后的壓力波形為規則的單峰鋸齒狀,隨著呼吸節律的變化有輕微的波動,低氧組小鼠的RVSP 明顯高于對照組[(30.48±2.95) mmHg 比(17.50±3.40) mmHg],差異有顯著性(P＜0.05),結果見表1、圖4a。

2.3 右室肥厚指數及肺小動脈病理改變

低氧組小鼠RVHI 也顯著高于對照組[(35.31±3.78)%比(23.14±4.29)%],差異有顯著性(P＜0.05),結果見表1、圖4b。 HE 染色顯示低氧組小鼠肺小動脈管壁明顯比對照組增厚,a-SMA 免疫組化染色顯示管壁增厚部分為平滑肌細胞,說明低氧組小鼠組織學水平也呈現出肺動脈高壓的病理變化,肺小動脈重構(圖5)。

表1 小鼠體重、RVSP、RVHI 的比較( ˉx ±s)Table 1 Body weight, right ventricular systolic pressure, and the index of right ventricular hypertrophy of the two groups

圖4 對照組和低氧組右心室收縮壓和肥厚指數的比較Figure 4 Comparison of RVSP and RVHI between the control group and the hypoxic group

圖5 肺小動脈的病理改變(× 200)Figure 5 Pathological changes of pulmonary arteriole

3 討論

隨著基因工程小鼠制備技術的發展和成熟,加之小鼠品系繁殖力強,繁殖周期短,飼養成本較低,基因背景較清楚[15],因此小鼠模型在肺血管疾病研究中的應用越來越多,右心室壓力測定是評估小鼠血流動力學的一種重要手段,有研究指出,右室流出道無狹窄及肺動脈瓣無病變時,肺動脈收縮壓與右心室收縮壓基本一致,通過測量右室收縮壓可間接反映肺動脈收縮壓[5,13]。 探求一種簡便快捷并易于普及的小鼠右心室血流動力學的測定方法有著非常重要的意義。

目前國內測定大鼠和小鼠右室及肺動脈壓力方法主要有經頸外靜脈V 形切口右心導管法,經導絲引導的右心導管法、開胸直視下穿刺右心室法或開腹經膈肌穿刺右心室法,其中報道最多的是右心導管法,由于是盲插,普遍面臨著導管在靜脈交匯處無法順利通過、誤入下腔靜脈、在右心房或右心室內打卷,刺破壁薄的靜脈引起胸腔內出血、導管前段刺激右心室引起心律失常等,導致檢測指標不準確或失敗[5,7-9,11]。 而對于導絲引導下的穿刺法雖然一定程度上減少了導管直接操作的盲目性,但需要X 線定位,增加實驗者放射線暴露[7]。 另外對于導管的選擇,要么價格昂貴(Millar 導管,3.5 萬人民幣),要么自制過程復雜(PE 導管)且易損耗[12],不利于實驗的進行。 開胸直視下穿刺右心室法需氣管插管和呼吸機通氣輔助,操作較為繁瑣,而且人為打開胸腔可能會影響心臟外周壓力,同樣開腹經膈肌穿刺也有著同樣的缺點,使得檢測指標不能反映正常心臟解剖條件下的血流動力學。 小鼠體型小、體重輕、血管壁薄及心臟體積小,進行上述操作問題更加突出,右心室血流動力學測定一直是肺動脈高壓小鼠模型評估中的一大難題,本實驗采用的經肋間肌穿刺法測定小鼠右心室壓力的實驗方法,較好地解決了這些難題。

實驗中通過分離小鼠胸部皮膚和淺層肌肉暴露肋間隙,觀察心臟的輪廓并判斷右心室的位置,從而進行準確的穿刺,由于操作簡便快捷和無需進行插管和呼吸機輔助通氣,大大縮短了測定壓力曲線所需要的時間,從胸部消毒開始到測出壓力平均需要3～4 min,同時也因胸腔密閉,減少了開胸對肺循環心臟血流動力學的影響,因而操作簡便快捷,結果真實可靠。 另外,使用材料主要有一次性輸液器針頭和手術器械及自制固定板,來源方便,能夠重復利用,不需要自行制備右心PE 導管,成本低廉。

操作步驟和技巧是取得實驗成功的關鍵。 我們總結出以下幾點操作細節:①要鈍性分離胸大肌、胸小肌以暴露肋間隙,避免損傷肋間肌及胸膜引起氣胸;②透過肋間隙觀察心臟時,左手手指一定要輕輕推擠胸壁,使心臟緊貼左胸前壁固定,這樣才能準確判斷右心室的位置;③穿刺時一定要掌握好進針角度和深度,進針角度為持針手偏向小鼠頭側和左側各15°左右,深10 mm 左右,事先做好標記,應注意一次性進針,進針后若波形未立即出現,可能是針尖口剛好貼著心肌壁,可輕微調整進針深度。 右心室穿刺成功后測壓應選取動物胸腔不受擠壓、RVSP 曲線穩定的那一部分作為實驗數據;④保證整個測壓系統密閉性和通暢性,管內不能留有氣泡,以免影響壓力傳導,每完成一次操作,要及時地推注注射器內的肝素生理鹽水,防止針頭內出現血凝塊,針頭變鈍時應及時更換。

本實驗中的肺動脈高壓小鼠模型為持續性低氧誘發,慢性缺氧引發肺動脈高壓的特征性變化是肺血管發生重塑,肺血管細胞尤其是平滑肌細胞發生慢性增殖,各級肺血管管壁明顯增厚,肺循環外周阻力增加,肺動脈壓進行性升高,最終導致右心室增大,發展為右心衰竭[9]。 本實驗結果顯示低氧組動物RVSP 和RVHI 顯著升高,病理示低氧組小鼠肺小動脈管壁明顯較對照組增厚和平滑肌細胞增殖,與國內外其它實驗測得的數據相近[12-13]。 綜上所述,本文詳細介紹了一種經肋間肌穿刺法測定肺動脈高壓小鼠模型右心室壓力的實驗方法,保持動物胸腔密閉無需呼吸機輔助,且操作簡單、方便快捷、成功率高,值得推廣應用。