恒河猴肺中陰溝腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

李艷艷,禹文海,楊鳳梅,劉 權,陳麗雄,王俊斌,馬 進,徐鴻界,楊亞平,趙 遠,和占龍

(中國醫學科學院/北京協和醫學院 醫學生物學研究所,云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室,昆明 650118)

陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)在自然界中廣泛存在,在人和動物的糞便、水、泥土、植物中都可檢出。 該菌為條件性致病菌,特定條件下能感染呼吸系統、泌尿系統等多個器官系統,同時也可感染創口,嚴重時引發敗血癥等[1]。 老年人和抵抗力降低的病人是該菌的易感人群。 該菌也可導致兒童腦膜炎、腦梗塞、腦膿腫和腦囊腫等疾病, 甚至引起死亡。 因此,陰溝腸桿菌已成為引起醫院內感染的一種重要的病原菌。 另外,陰溝腸桿菌B29 是國際上公認的“肥胖細菌”,它是造成肥胖的直接元兇之一[2]。 大量研究報道,由于抗生素類藥物的不合理使用,使陰溝腸桿菌對多種抗菌藥物具有較高的耐藥性[3-4],陰溝腸桿菌普遍對第一代至第四代頭孢類、青霉素類等藥物有90%以上的耐藥率,這為臨床用藥的選擇帶來很大困難。 經過多年對恒河猴的飼養觀察發現,恒河猴呼吸系統疾病發病率高,嚴重時可引起死亡。 本文首次在恒河猴的肺組織中分離到陰溝腸桿菌,通過藥物敏感性試驗,確定治療陰溝腸桿菌的首選藥物,為今后的臨床治療工作提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級雄性恒河猴1 只,8 歲,體重約7 kg。 健康KM 小鼠10 只,雌性,6 ～8 周齡。 恒河猴及KM小鼠均來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所醫學靈長類研究中心(恒河猴生產許可證號[SCXK(滇) K2015-0004],使用許可證號[SYXK (滇)K2015-0006];KM 小鼠生產許可證號[SCXK (滇)K2014-0002],使用許可證號[SYXK (滇) K2014-0007])。 實驗內容經本單位動物實驗倫理審查委員會審查通過(批準號:DWSP201902034),實驗過程按實驗動物使用的3R 原則給予實驗動物人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

SS 瓊脂(青島日水生物技術有限公司,批號20140522)、GN 增菌液(青島日水生物技術有限公司,批號20140215)、三糖鐵瓊脂(青島日水生物技術有限公司,批號20140331),ID 32 E 生化鑒定試條(梅里埃公司),藥敏紙片(北京天壇生物技術開發有限公司)。 電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)、ATB Expression 儀(法國梅里埃公司)。

圖1 恒河猴病變Figure 1 The lesions of rhesus monkey

1.3 實驗方法

1.3.1 病例資料

該恒河猴身體健康,由人工飼養,每日喂以基礎飼料[5],自由飲水。 每日清洗猴籠,定期消毒。通過日常飼養觀察發現該恒河猴表現為呼吸困難,精神沉郁,厭食,活動減少等癥狀,立即轉入治療室單籠飼養及治療,靜脈輸液青霉素(80 萬單位/次)3 d 后病情好轉,停藥觀察,該猴精神及飲食情況并未完全恢復。 在治療室內隔離觀察20 d 后放回大籠飼養,于放回大籠第2 天死亡。 尸檢外觀可見腹部鼓氣(見圖1A),解剖心臟、肝、脾、胰腺、腎、腎上腺、膀胱未見異常,胃、腸管內充氣(見圖1B),部分腸道呈出血性炎性變化,雙肺下呈充血、出血,邊緣部分肉樣肺炎病變(見圖1C)。

1.3.2 病料采集及培養

解剖柜條件下解剖死亡猴,用無菌手術剪切開肺組織,用滅菌接種環在肉眼病變明顯和正常肺組織部位采樣,接種于GN 增菌液,在恒溫培養箱(37℃)內增菌8 h 后,接種SS 瓊脂培養基,將平皿倒置放于37℃恒溫培養箱中培養18 ～24 h 后觀察結果。

1.3.3 細菌分離培養

挑選SS 瓊脂培養基上典型菌落穿刺接種于三糖鐵瓊脂鑒別培養基,置于37℃恒溫培養箱中培養18～24 h,作進一步的分離培養和產酸產氣等培養特征的鑒定。 同時挑取單個菌落進行革蘭氏染色,鏡檢。

1.3.4 細菌生化鑒定

細菌生化鑒定采用法國生物梅里埃公司ATB細菌鑒定系統及配套ID 32E 鑒定卡。 按照說明書,在鑒定卡中加入樣品后放37℃培養箱內培養,18 ～24 h 內觀察生化反應結果。 將反應結果編號輸入ATB 鑒定系統,判定結果。

1.3.5 藥敏試驗

用紙片擴散法,對分離到的細菌進行常用抗菌類藥物的敏感性試驗。 平皿置于37℃培養24 h 后取出,觀察并測量抑菌圈直徑大小(mm)。 結果判定按美國CLSI 的抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準進行[6]。 所用8 種藥敏試紙片如下表。

表1 藥敏紙片及規格Table 1 Specification of drug-sensitive paper

1.3.6 病理檢查

取肉眼見明顯病變部位,4%甲醛溶液固定后制作病理切片,HE 染色,鏡檢。

1.3.7 小鼠致病性試驗

用滅菌生理鹽水將分離純培養的細菌稀釋,ATB 比濁儀調整菌液濃度為4 McF。 設立實驗組和對照組,實驗組6 只小鼠,腹腔注射菌液0.5 mL/只,對照組4 只小鼠,腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL/只。 記錄發病及致死情況,解剖死亡小鼠,記錄病理變化,無菌條件下采集肺臟組織進行細菌分離培養。

2 結果

2.1 菌落特性

細菌經培養在SS 培養基上生長成濕潤、表面光滑、白色或乳白色、不透明的圓形菌落(如圖2A),革蘭氏染色鏡檢,可見革蘭氏陰性小桿菌(如圖2B)。

圖2 恒河猴肺組織分離菌菌落及菌體形態Figure 2 Colony and bacterial morphology from lung in rhesus monkey

2.2 生化特性

三糖鐵培養基分離培養,該菌產酸產氣。 將ID 32E 鑒定卡反應結果編號輸入ATB 鑒定系統,判定該細菌為陰溝腸桿菌, ID 為99.9%,T 為0.71,ID編碼35074753311,生化結果見表2。

2.3 藥物敏感性試驗

陰溝腸桿菌藥敏試驗測得的抑菌圈直徑大小見表3。 從表中可看出該菌對氨芐西林、頭孢呋辛中等敏感;對諾氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢噻肟敏感。

2.4 病理結果

肺部病變明顯部位制作病理切片,鏡檢可見肺內炎性肉芽腫形成(圖3A),泡沫細胞聚集,血管支氣管周圍淋巴細胞浸潤(圖3B)。

表2 細菌生化特性檢測結果Table 2 Detection results of biochemical characteristics

2.5 小鼠致病性試驗

實驗組小鼠于接種菌液后5 h 出現活動減少、精神萎靡、閉目、呼吸急促等臨床表現,19 h 內全部死亡,解剖可見肺葉出血、胃腸鼓氣、十二指腸腸壁變薄等病變(如圖4A、4B)。 取病變肺臟組織進行細菌培養,分離出陰溝腸桿菌,表明該株陰溝腸桿菌對小鼠有較強的致病性。 對照組小鼠行為表現及剖檢情況均正常(如圖4C)。

3 討論

陰溝腸桿菌屬腸桿菌科腸桿菌屬,是條件致病菌,通常在人和動物的腸道內寄生。 如朱旗[7]等發現在賽馬腸道菌群中存在陰溝腸桿菌,黃小蘭[8]等從圈養滇金絲猴糞便中分離到陰溝腸桿菌。 近年來陰溝腸桿菌備受關注是因為其引發的呼吸系統感染疾病日益增多。 大量研究表明,某些嚴重的基礎疾病如燒傷、手術創傷、惡性腫瘤等,以及實施氣管切開、導尿、靜脈插管等侵入性診療操作,都能破壞機體免疫屏障結構,造成免疫功能降低;另外激素等免疫抑制劑、化療藥物、抗生素的大量應用及不適當的聯合用藥抑制了正常菌群,使機體內的正常菌群大量減少,導致陰溝腸桿菌等條件致病菌增多并大量繁殖成為優勢菌種[9],并定位移植到腸外的其他器官系統,感染部位主要是下呼吸道和泌尿道[10]。 目前,對人類由陰溝腸桿菌引起的疾病研究較多,動物方面也較常見。 如陰溝腸桿菌引起呼吸系統疾病的報道,包扣大熊貓呼吸道、七彩山雞肺臟、亞洲黑熊肺臟、綿羊肺部、牛肺臟感染[11-13];另有陰溝腸桿菌引起孔雀胚死亡、羅氏沼蝦幼蝦死亡、與馬鏈球菌獸疫亞種混合感染引起的馬出血性敗血癥等報道。 但未見恒河猴感染的有關報道。本文中該恒河猴由治療室轉出后突然死亡,可能是由于治療室與飼養大籠溫差較大,且突然改變環境引起的。 病理變化主要為呼吸系統和消化系統,與由陰溝腸桿菌單獨感染引起的綿羊肺炎的病理變化,如肺尖葉、心葉、隔葉呈不同程度的出血、充血及肝變,消化道表現為輕重不同的卡他性和出血性炎癥變化基本一致[14]。 恒河猴腹瀉及肺炎是常見病與多發病,嚴重者導致死亡。 本文從死亡恒河猴肺中分離到陰溝腸桿菌,這可能與恒河猴腹瀉時抵抗力下降以及不適當的使用廣譜抗菌藥物,致使恒河猴體內菌群失調,導致陰溝腸桿菌從消化道移位到呼吸系統有關。 另外也可能與院內獲得性感染有關,隨著住院時間的延長,恒河猴與病原微生物接觸的機會增加,危重情況下更易感染陰溝腸桿菌。 因此入院后應隔離治療,避免交叉感染。

陰溝腸桿菌與銅綠假單胞菌、鮑曼氏不動桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌是引起下呼吸道感染的主要革蘭陰性腸桿菌。 陰溝腸桿菌的耐藥機制較為復雜,包括作用靶點的改變、主動外排活躍和外膜蛋白缺失、整合子、qnr 基因介導、產生β-內酰胺酶等,其中產超廣譜β-內酰胺酶是腸桿菌科細菌最主要的耐藥機制。 長期使用大量的抗菌藥物會引起細菌耐藥和交叉耐藥,造成臨床治療失敗,使臨床感染治療面臨潛在威脅[15-16]。 本研究中陰溝腸桿菌對8 種所試抗菌藥物均敏感,未出現耐藥的情況,這可能與治療時間較短有關系。 在我國獸醫臨床治療過程中,濫用抗菌藥物的現象極為普遍,僅憑經驗長期大量的使用廣譜抗菌藥物會引起動物體內菌群失調,導致陰溝腸桿菌感染及耐藥性的產生。 因此在實際工作中,為了有效控制該菌所致的各種感染,要做到以下幾點:首先,采取有效的隔離措施,及時、正確治療嚴重的基礎疾病,做到早發現早隔離早治療;其次避免或縮短侵入性操作,降低陰溝腸桿菌侵入性感染的機率;同時加強抗菌藥物的流通管理工作,根據藥敏試驗選用抗菌藥物,合理使用抗生素和激素,減少陰溝腸桿菌耐藥性的產生;最后做到徹底消毒滅菌,避免陰溝腸桿菌的散播。

本研究中,從死亡恒河猴肺中分離到陰溝腸桿菌,該株陰溝腸桿菌對小鼠具有較強的致病性。 藥敏試驗結果表明陰溝腸桿菌對頭孢哌酮、頭孢噻肟最敏感,這為今后發現相同疾病的臨床治療工作提供一定的理論依據。

表3 陰溝腸桿菌藥敏試驗結果Table 3 Susceptibility test results of pneumonia pathogenic bacterium in rhesus monkey

圖3 恒河猴肺組織病理改變(HE 染色,× 100)Figure 3 Pathological changes of lung in rhesus monkey. HE staining

圖4 小鼠病變Figure 4 The lesions of mice