基于2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪功能單體水相氫鍵的應用研究進展*

王小濤，徐俊陽，謝 遜，劉最芳

(湖北工業大學 材料與化學工程學院，綠色輕工材料湖北省重點實驗室，武漢 430068)

0 引 言

功能單體2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(VDAT)是帶有多個潛在氫鍵位點的“疏水性”(低水溶性)單體(見圖1)。值得注意的是，該功能單體具有多個潛在氫鍵結合位點，在水相中單體與單體之間強大的氫鍵作用力大于單體與水之間的氫鍵作用力，所以該單體在水相中仍然能形成有效而強烈的氫鍵作用。這種特性對于在水相中作為藥物載體通過氫鍵作用力和“疏水親和力”吸附某些低水溶性的小分子具有極大地幫助，是一種不可多得的功能單體。然而，也正是由于VDAT是在水中溶解度很低的固態化合物，且常用良溶劑只有二甲亞砜，此理化特征限制了該功能單體的應用，所以有關報道相對比較少。目前已有研究者將該功能單體設計成聚合成薄層、凝膠、納米或微米粒子等，本文綜述了其性能的研究及在生物醫學領域的應用，希望能挖掘VDAT功能單體更多的應用潛力。

圖1 VDAT分子結構和與其它分子/基團形成氫鍵的潛在位點

1991年，Kunitak等人[1]研究表明，含有4，6-二氨基三嗪分子的Langmuir-Blodgett膜通過氫鍵在空氣/水界面處可結合尿苷和胸苷，為聚合物受體在水相中氫鍵分子識別方面的應用奠定了基礎。

Asanuma等人[2-4]報道了VDAT作為功能單體及其聚合物的早期研究。研究結果表明，在水中，聚2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(PVDAT)通過二氨基三嗪(DAT)氨基的多個氫鍵位點在聚合物鏈上誘導出的非晶微環境促進了水溶液中氫鍵的形成，從而可選擇性識別核酸堿、核苷酸和核苷。紅外光譜(IR)已證實了配合物與PVDAT之間氫鍵的形成，小分子吸附量的大小與其跟DAT氨基形成的氫鍵數目有關：尿嘧啶和胸腺嘧啶具有朝向DAT的3個氫鍵位點，而胞嘧啶只具有兩個氫鍵位點，結果表明聚合物對胞嘧啶的吸附量小得多；鳥嘌呤的小結合活性歸因于二者復雜的三維結構形成了空間排斥作用。除此之外，PVDAT均聚物對尿嘧啶和胸腺嘧啶的吸附是完全可逆的；乙烯基二氨基三嗪-丙烯酰胺共聚物在水中也可與胸腺嘧啶形成氫鍵，而相應的單體卻不形成氫鍵，說明了聚合物效應可極大促進PVDAT中DAT氨基的結合活性。這些發現有力地說明了聚合物作為人工載體的前景，它可以通過氫鍵精確識別并吸附水中的客體分子，為實際應用(如治療和調節生物反應)打下基礎。

1 分子印跡

根據早前報道，VDAT功能單體已成功用于某些分子印跡領域。Slinchenko等人[5]以VDAT為功能單體，在硅烷化玻璃表面上通過聚合VDAT、丙烯酰胺、交聯劑和模板毒素雙鏈DNA(dsDNA)成功制備了能識別Vero毒素基因的dsDNA印跡聚合物(MIP)。研究結果表明，VDAT與dsDNA中的A-T堿基對之間存在氫鍵作用力。通過利用熒光標記dsDNA研究了該水凝膠薄層用于結合Vero毒素dsDNA的特異性，表明了這種涂覆有印跡聚合物的玻璃微滑塊可用作檢測目標dsDNA序列的選擇性表面。在相互作用力方面，這種聚合物確實因VDAT與dsDNA之間的氫鍵作用力而帶有特異性，但是在分子印跡方面還可以研究的更深入。

分子印跡聚合物除了以薄層的形式存在，Ogiso等人[6-7]還使用VDAT作為功能單體合成了dsDNA分子印跡聚合物水凝膠(MIP gel)。該MIP gel因VDAT具有許多氫鍵結合位點，這些結合位點在大小、形狀和目標dsDNA序列的功能基團排列上是互補的。這種以MIP gel為電泳基質來檢測dsDNA特定序列的方法是基于電泳過程中MIP gel結合位點的捕獲效應, 通過繪制MIP gel中的遷移距離與聚丙烯酰胺凝膠(凝膠電泳中常用)中的遷移距離間的關系來確定目標dsDNA的遷移障礙。研究結果表明，其他點的突變體可以應用于MIP gel，對于MIP gel中的A-T (T-A)堿基對識別還需要一些改進。這種MIP gel制備方法簡單，成本低，未知序列dsDNA既可作為模板也可作為靶向dsDNA，在一般醫學和法醫學的目標DNA分離和檢測技術上有一定的應用潛力。

圖2 凝膠電泳中dsDNA印跡聚合物凝膠檢測靶dsDNA序列原理圖[6]

為了深入地了解分子印跡聚合物，蘇婷婷等人[8]以VDAT為功能單體、苯巴比妥(PHN)為印跡分子討論了PHN分子印跡聚合物(PHN-MIPs)的鍵合條件。采用混合密度泛函方法(M062X)研究了PHN和VDAT的幾何優化，自然鍵軌道(NBO)電荷和分子靜電勢(MEP)并通過氫鍵長度和分子中的原子(AIM)理論討論了PHN分子印跡聚合物(PHN-MIP)的鍵合條件。研究結果表明，PHN和VDAT之間是通過氫鍵相互作用，當二者比例為1：4時穩定復合物腔中有10個氫鍵。該研究有助于選擇印跡比，特異性研究也為通用分子印跡材料的合成提供了理論依據，還可以為改進分子印跡技術提供系統的理論參考。但是，僅僅理論上的研究實際上不足以支撐分子印跡方面的進展，投入更多地科學實驗研究是非常有必要的。

2 水凝膠

在水凝膠的應用方面，VDAT因DAT氨基的作用不僅可以作為一種機械增強劑，而且還可以賦予水凝膠DNA結合能力和pH響應性。通過與親水單體和/或交聯劑共聚，PVDAT的應用已擴展到基因傳遞載體的構建和不膨脹、高強度水凝膠的構建。在基于VDAT功能單體的水凝膠中，出現了許多吸引人的特性，如優異的力學性能、刺激反應能力、形狀記憶效應、導電性和生物降解性[9]。

在基因傳遞載體的構建方面，曹智強等人[10]開發了基于PVDAT的聚合物非病毒載體，這是通過氫鍵特異性結合質粒DNA(pDNA)堿基對的新型基因轉移系統。采用常規自由基聚合法合成了PVDAT均聚物及其與聚1-乙烯基-2-吡咯烷酮(PVP)共聚物P(VDAT-co-VP)并純化得到水溶性部分。研究結果表明，在使用編碼熒光素酶或增強綠色熒光蛋白的pDNA轉染研究中，該系統可以有效地轉染COS-1細胞。與商業化聚陽離子系統ExGen500相比，該系統表現出更高的轉染效率、更低的細胞毒性、更好的血清相容性的優點，而且在牛血清白蛋白(BSA)存在下有更好的穩定性。另外，葉桂香等人[11]對這種新建立的PVDAT聚合物/ pDNA體系進行了表面電荷和復雜尺寸的進一步研究，并對其細胞內化機理進行了初步探討。研究表明，該PVDAT基聚合物能覆蓋DNA的表面電荷，形成輕微的負電或中性配合物；這種配合物的尺寸受兩個因素的影響：中性粒子不穩定引起的聚集和PVDAT基聚合物產生的更緊密的配合物。在細胞攝取機制研究中，使用氯丙嗪和絲氨酸Ⅲ作為內吞抑制劑，表明PVDAT系統可能通過無網絡蛋白，非腔靜脈介導的內吞作用進入細胞。利用溫度抑制和動力學分析研究該特殊過程，結果表明這一途徑的特點是：(1)能量依賴性較強；(2)很慢的轉染-有效的內化。

唐磊等人[12-13]分別基于VDAT、交聯劑聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和2-(2-甲氧基乙氧基)甲基丙烯酸乙酯(MeO2MA)/ N-異丙基丙烯酰胺共聚合成高強度溫敏水凝膠。研究結果表明，VDAT的加入能顯著提高水凝膠的力學強度，力學性能的提高歸因于氫鍵強化效應，它通過疊加一個擴展的芳香核而形成相對剛性的六元環結構。另外，VDAT分子間形成的氫鍵還賦予了水凝膠結合DNA的能力實現反向基因轉染。在不添加任何酶的情況下，通過熱誘導親疏水性變化可以分離和收獲基因修飾的細胞，這種低細胞毒性水凝膠有望作為可植入的基因錨定基質或支架用于基因治療和組織工程應用。

VDAT中的DAT-DAT氫鍵相互作用在提升水凝膠強度和綜合性能方面起很重要的作用，基于此可合成多種類型水凝膠并具有多方面的應用潛力。例如，離子交聯氫鍵增強水凝膠為制備高強度形狀記憶水凝膠開辟了一條新的途徑，可用于多種生物醫學應用，如無損細胞收獲和軟組織替代物[14]，另一種高強度彈性水凝膠也將可用作軟組織工程支架[15]；離子響應氫鍵增強水凝膠可集抗菌、抗炎和傷口愈合功能于一體[16]；強光敏水凝膠不僅可以實現高效的反向基因轉染，引入光反應的螺吡喃單元在紫外光照射下可使水凝膠產生可逆的親疏水性轉變，這種氫鍵作用與光響應結合的水凝膠將在生物醫藥領域廣泛應用[17,18]；除此之外，通過原位混合制備的高強度導電水凝膠在軟組織工程生物傳感器、柔性電極材料和支架材料將有廣泛的應用前景[19]。以上各種水凝膠都是靠VDAT或者VDAT與其他單體的協同作用獲得較高的綜合力學性能，足以表明該單體的貢獻是不可忽視的。

據最新報道，劉最芳課題組[20]還制備了一種含VDAT的雙物理交聯高強水凝膠,VDAT通過DAT-DAT氫鍵相互作用誘導第一交聯點的形成并與聚丙烯酰胺-丙烯酸P(AM-co-AC)鏈相互作用，二次物理交聯劑Fe3+引入在Fe3+和-COO-基團之間。研究結果表明，由于氫鍵和離子配位的協同作用，水凝膠具有高抗拉強度，大伸長率，切割成兩片后在堿液條件下具有良好的愈合性能。在共聚物鏈中加入VDAT單元，不僅可以在水含量大(水含量>65%)的情況下形成穩定的氫鍵交聯，而且使水凝膠可以物理吸附類似抗腫瘤5-氟尿嘧啶(5-Fu)等具有特定空間排列化學成分的分子。該雙物理交聯水凝膠對生物小分子有選擇性吸附，可組裝成高靈敏度的柔性可穿戴裝置，在構建電容傳感器方面的潛力也得到了探索。

圖3 雙物理交聯水凝膠形成示意圖[20]

基于PVDAT的水凝膠不僅具有較高的綜合力學強度，而且由于DAT氨基的可逆質子化而具有pH敏感性。高寒等人[21]制備了由兩種氫鍵單體VDAT和3-丙烯酰胺基硼酸共聚合的新型pH敏感高強度水凝膠。研究表明，由于兩種單體分別能在酸性和堿性介質中形成氫鍵，在pH變化過程中除化學交聯外還可以至少保持一個額外的強物理交聯。所以，雙氫鍵水凝膠在較寬的pH范圍內具有較高的抗拉強度和抗壓強度，擴大了其在生物醫學和工業中的應用。

另外，王青等人[22]利用兩種特征氫鍵單體VDAT和N-丙烯酰基甘氨酰胺(NAGA)通過一步共聚反應制備了高強度pH響應的超分子聚合物(SP)水凝膠。研究結果表明，NAGA的氫鍵在增強強度中起主導作用，pH響應取決于VDAT的DAT基團，當pH值低于DAT的pKa時，氨基質子化后產生的靜電排斥作用導致氫鍵的斷裂。這種PNAGA-PVDAT水凝膠在離子化狀態下仍能保持較高的機械強度，可能在生物醫學和工業領域得到廣泛的應用。

一般PVDAT水凝膠由于引入穩定的化學交聯而無法降解。吳騰玲等人[23]采用光引發聚合的方法，以VDAT和甲基丙烯酸明膠(GelMA)為單體，合成了一種機械性強、pH響應性好、可生物降解的水凝膠。研究結果表明，二氨基三嗪的氫鍵對水凝膠的力學性有顯著的增強作用，同時起著pH響應的作用，該水凝膠開發在胃滯留填充劑或作為減肥干預和給藥方面的潛在應用。

圖4 (a)PNAGA(聚N-丙烯?；拾滨０?和PNAGA-PVDT-X(聚N-丙烯?；拾滨０?聚2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-X，X指VDT質量比)水凝膠在pH3和7.4處測定的壓縮力學性能；(b)PNAGA-PVDT-2.5水凝膠壓縮數字圖像[22]

3 納/微米粒子

聚合物納米粒子具有比表面積大、表面活化能高、吸附性能強、量子尺寸效應等優點。將VDAT聚合成為納米粒子成功開拓了新的研究方向。然而，VDAT是水溶性很差的固態化合物，所以很難用傳統聚合方法去制備聚合物，迄今發表的VDAT聚合物合成也多半是在有機溶劑中進行，我們課題組首次創新性地采用水相半連續沉淀聚合法合成了粒徑可控的PVDAT納米粒子及微米粒子并進行了吸附研究。

圖5 半連續沉淀聚合法合成聚VDAT納米粒子原理圖

早期，以VDAT為單體，2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(V-50)為引發劑采用水相半連續沉淀聚合法合成了帶表面正電荷的PVDAT納米粒子。PVDAT納米粒子室溫下在水中具有良好的穩定分散性。研究結果表明，PVDAT納米粒子由于每個二氨基三嗪基團可以與尿酸形成3個氫鍵，所以在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中表現出對尿酸的快速吸附。同時尿酸屬低水溶性，減小了水分子對其和PVDAT納米粒子形成氫鍵的影響，這種吸附屬于多重氫鍵和“疏水親和力”的協同作用。另外，當納米粒子摻入酶墨中還可制成絲網印刷的葡萄糖生物傳感器[24]。

在微球方面，我們首次利用功能單體VDAT和聚苯乙烯微球(PS)，采用水相半連續沉淀聚合法在水相中合成了PVDAT@PS核殼微球并對不同dsDNA進行吸附。研究結果表明，帶正電荷的PVDAT是通過靜電作用包覆于帶負電荷的PS微球表面，最佳包覆且包覆厚度約為0.15 μm。當A-T堿基對百分數一致時，DNA鏈段越長，吸附容量越大；當DNA鏈段的長度一致的情況下，鏈段中A-T堿基對含量越高，越有利于吸附[25-26]。在保證PVDAT功能層的前提下該微球的大小可以通過調控PS球的大小得到，對生物大分子的理論吸附性表明該研究在生物領域將具有十分巨大的潛在價值。

另外，利用功能單體VDAT采用水相半連續沉淀聚合法合成了同質核殼結構的PVDAT納米粒子并對聚合機理進行初步研究。研究結果表明，當VDAT被引發并完成鏈增長至沉淀成核形成小粒子，逐步消溶沉積到PVDAT納米核上，從而形成同質核殼結構的PVDAT納米粒子，當PVDAT納米核含量為1.25%，VDAT單體為1.25%，引發劑V-50為1%時粒徑從139 nm增長到214nm，此增長過程屬于典型的Ostwald熟化機制。該研究表明殼的厚度可控，為VDAT功能單體水相制備蛋白質分子印跡聚合物納米粒子打下基礎[27]。

在研究聚合物納米粒子吸附性方面，采用水相半連續沉淀聚合法合成VDAT聚合物納米粒子并研究了pH和離子強度對PVDAT吸附牛血紅蛋白(BHb)的影響。研究結果表明，聚合過程中VDAT單體和引發劑的比例和加樣速率是獲得較好的顆粒形貌和較窄的粒徑分布的關鍵因素。pH值在5-12的變化對吸附容量的影響是蛋白質的電荷狀態和DAT質子化共同作用結果；當離子強度從1.0增加到200 mmol/L，吸附容量不斷下降。Langmuir等溫線研究和粒子覆蓋率估算表明，BHB大分子在納米粒子表面以單層形式吸附，結果表明納米顆粒表面的DAT基團與蛋白質表面的氨基酸基團間的氫鍵作用對吸附起決定性作用，而靜電引力/排斥和疏水親和力同樣具有重要作用[28]。

4 其 它

此外，陳兆斌等人[29]合成了含VDAT的抗菌聚合物。通過常規自由基聚合法合成PVDAT，VDAT與苯乙烯(PS)共聚形成P(PS-co-VDAT)，經氯漂白劑處理后，PVDAT和P(PS-co-VDAT)對多藥耐藥革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有較強、耐用且可再充電的抗菌作用。此前有研究表明聚合氯胺可以是一類有效的抗菌材料。研究表明，經氯漂白劑處理后，VDAT基高分子材料中可形成氯胺結構從而顯示出抗菌作用，所以與VDAT共聚是將普通聚合物轉化為抗菌材料的有效途徑。

Hammer等人[30]合成了對硝基苯芳香分子具有高親和力的P(PS-co-VDAT)無規共聚物薄膜。由于聚合物鏈上的氨基與硝基基團之間存在氫鍵，VDAT基團對4-硝基甲苯具有很強的親和力，該共聚物在4-硝基甲苯的飽和氣氛中僅有4秒的曝光后折射率就增加。硝基苯芳香分子是炸藥上方蒸汽的組分，該研究已證明當4-硝基甲苯進入聚合物薄膜時，折射率增加且響應迅速，但是為了實現一個工作傳感器，還必須證明是吸收了特定分析物而不是其他任何揮發性物質導致折射率的變化，該研究為探測爆炸裝置打下基礎。

Kuo等人[31-32]利用VDAT分別于甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和苯乙烯(PS)自由基共聚形成P(VDAT-co-MMA)和P(PS-co-VDAT)共聚物。研究結果表明，VDAT帶來的氫鍵作用力可顯著提高P(VDAT-co-MMA)共聚物的熱性能，玻璃化轉變溫度(Tg)顯著增加，并且由于超分子聚合物的形成而顯著增加了粘度；另外，多氫鍵單元VDAT結合到先前不相容的PS二元共混物中增強了超分子形成時的混溶性，其中當VDAT以7%(摩爾分數)這樣較低含量摻入主鏈時即可增加PS混溶性。

Taguchi等人[33]通過自由基共聚合法合成了一種含VDAT的新型氫化氟化二元梳狀共聚物，梳狀共聚物在蒸餾水上形成穩定的凝聚單層膜，研究了DNA分子對梳狀共聚物在空氣/水界面上的吸附行為及其分子排列。研究結果表明，DNA水溶液上單層膜的π-A等溫線結果顯示每個VDAT單元的分子面積值的增加對應于2 nm2，轉移LB多層膜的紅外光譜表明DNA分子是通過氫鍵吸附在共聚物模板上。

5 結 語

VDAT功能單體能夠在水相中形成強烈而有效地氫鍵作用力，在分子印跡、水凝膠及納/微米粒子等方面已經展現出獨特的優勢。雖然因VDAT是固態化合物，在水中的溶解度很低造成了一定的困擾，但是根據已有報道顯示出了VDAT在生物醫藥領域巨大的應用前景?；赩DAT功能單體的各種響應性的水凝膠前景無限廣闊，各種環境友好型的水凝膠也有待開發，這將是非常優異的材料并將在生物等領域得到廣泛應用。特別地是，如何設計該單體在藥物載體以及分子印跡方面的應用也是一個值得探索和非常具有前景的研究方向?；谠搯误w的研究道路還很長，需要各界人士不斷創新和不懈努力才能讓它功能最大化，在科研中大放異彩。