基于“甾酮類化學成分-抗氧化生物活性”關聯分析評價牛膝藥材商品等級

常愛冰，劉妍如*，王 梅，唐志書，宋忠興，史鑫波，劉 峰，陳彥斌

1陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同中心 省部共建協同秦藥特色資源研究與開發重點實驗室(培育)陜西省創新藥物研究中心；2陜西中醫藥大學附屬醫院，咸陽 712083； 3陜西步長制藥有限公司，西安 710075

牛膝來源于莧科植物牛膝(懷牛膝)AchyranthesbidentataBl.的干燥根。具有補肝腎、強筋骨和活血祛瘀等功效[1]，臨床上常用于血滯經閉、胞衣不下和跌打損傷等癥。現代藥理研究表明牛膝具有增強免疫、抗氧化和抗炎鎮痛等功能，其機理為抑制自由基的產生[2-7]。

作為中醫臨床常用藥物之一，其質量優劣直接關系到臨床用藥的安全性[8]。目前牛膝藥材的質量控制主要參考2015版藥典對于蛻皮甾酮含量的規定。中藥有別于化學藥和生物制品，單一的感官評價、化學評價或生物評價均無法全面反映中藥的整體質量和臨床功效[9]，多元化的交叉綜合評價模式將會成為中藥質量評價的趨勢[10]。因此本研究以抗氧化活性作為生物活性指標，同時結合牛膝甾酮類化學成分的含量測定結果。建立一種基于“甾酮類化學成分-抗氧化生物活性”關聯研究思路的Logistic回歸模型，為牛膝藥材的質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITYH_ClASS型超高效液相色譜儀(美國沃世特公司)：包括二元超高壓溶劑系統、FTN自動進樣管理器、PDA檢測器和Empower3 色譜工作站；1510型全波長酶標儀(美國賽默飛世爾公司)；Sartorius CPA225D十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品25R-牛膝甾酮(批號HS94175W2)、25S-牛膝甾酮(批號H1098998198)均購于寶雞辰光生物科技有限公司，純度≥98%；對照品β-蛻皮甾酮(批號MUST-18120209)購于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥99%；ABTS自由基試劑盒和羥自由基試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼購于上海源葉生物科技有限公司；醋酸(色譜純)購于西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司；乙腈(色譜純)購于德國默克公司；水為超純水，其余試劑為分析純。

1.3 材料

牛膝藥材主要收集于河南、河北、內蒙等地，經陜西中醫藥大學劉世軍副教授鑒定為莧科植物牛膝(懷牛膝)A.bidentataBl.的干燥根，憑證標本存放于陜西中藥資源產業化協同創新中心，具體信息見表1。

表1 21批牛膝藥材信息Table 1 Collection information for 21 batches of A.bidentata

續表1(Continued Tab.1)

2 方法

2.1 牛膝甾酮類成分含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?BEHC18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為0.2%乙酸水溶液(A)-乙腈溶液(B)。梯度洗脫程序為0～1 min，2% B；1～21 min，2%→22% B；21～25 min，22%→2% B；25～28 min，2% B。體積流量0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣2 μL，檢測波長為250 nm。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品制備

精密稱取β-蛻皮甾酮、25S-牛膝甾酮、25R-牛膝甾酮對照品，加甲醇溶解，制成質量濃度分別為0.1、0.8、0.1 mg/mL對照品溶液，備用。

2.1.2.2 供試品制備

精密稱取本品粉末(過三號篩)1 g，置具塞錐形瓶中，加水飽和正丁醇30 mL。浸泡過夜后超聲處理30分鐘，過濾，用甲醇10 mL分數次洗滌容器及殘渣。合并濾液和洗液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度即得。

2.1.3 含量測定

將“2.1.2.1”項下對照品溶液及“2.1.2.2”項下的供試品溶液，按照“2.1.1”項下的色譜條件，分別進樣2 μL進行含量測定。

2.2 抗氧化生物活性指標測定

2.2.1 ABTS自由基清除能力的測定

具體操作參照ABTS自由基試劑盒說明書，首先進行標準曲線的繪制得到線性方程為Y=-1.666 4x+2.285，決定系數r=0.999 2。將各批次牛膝的吸光值帶入方程即得清除能力(A1)，同理得出對照溶液的清除能力(A0)。每個樣品設三個復孔，按公式(1)計算清除率。

ABTS自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%

(1)

2.2.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考文獻[11]稍作修改，用無水乙醇將DPPH配成2 mmol/L的溶液。實驗設空白組、樣品組與對照組，每個樣品設三個復孔。樣品組中加入150 μL的DPPH溶液和150 μL牛膝各批次提取液(A1)；空白組中加入150 μL的無水乙醇溶液和150 μL牛膝各批次提取液(A2)；對照組中加入150 μL的DPPH溶液和150 μL的無水乙醇溶液(A0)。混勻，室溫下避光靜置30 min，用酶標儀測定517 nm處吸光值。按公式(2)計算清除率。

DPPH自由基清除率=

[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

2.2.3 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

具體操作參考南京建成生物工程研究所提供的羥基自由基試劑盒說明書。分別測定對照品溶液(A0)與各批次牛膝樣品(A1)吸光度值，按照公式(3)計算清除率。

羥自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%

(3)

2.3 牛膝藥材等級分類

2.3.1 Logistic回歸模型建立

采用SPSS 22.0軟件建立回歸模型。首先通過主成分分析方法找到牛膝藥材等級相關的主要影響因素，該影響因素即為自變量。其次對模型進行擬合，擬合過程如下：將21批實驗數據集分成訓練集和測試集兩部分，對訓練集樣品的自變量數據進行 Logistic回歸分析。最后建立回歸模型pi=exp(βi0+β1X1+...βχn)/[1+exp(βi0+β1X1+...βχn)]，其中p為概率值，x1,…xn為自變量。然后根據該模型對測試集樣品進行分類預測，預測結果P≥ 0.8則判定為該等級。藥材等級賦予響應值4、3、2、1，分別代表優(I)、良(II)、中(III)、差(IV))4個等級。

3 結果

3.3 方法學考察

3.1.1 系統適用性考察

將供試品溶液和對照品溶液分別進樣2 μL，記錄250 nm波長下的色譜圖。通過比較保留時間和峰面積，可以看出甾酮類各成分的分離度均符合測定要求，結果見圖1。

圖1 牛膝藥材及混合對照品UPLC圖譜Fig.1 UPLC map of A.bidentata and its control注：1.β-蛻皮甾酮；2.25R-牛膝甾酮；3.25S-牛膝甾酮。Note:1.β-Ecdysterone;2.25R-Inokosterone;3.25S-Inokosterone.

3.1.2 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液，用甲醇逐級稀釋。分別按“2.1.1”項下色譜條件分析，進樣量為2 μL測定峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)，繪制各標準曲線。結果見表2，3個甾酮類成分在各濃度范圍內的線性關系良好。

表2 3個甾酮類成分的線性回歸方程、相關系數和線性范圍Table 2 Regressive equations,correlation coefficients,linear ranges between three phytoecdysones

3.1.3 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，重復進樣6次，考察精密度。結果顯示，各甾酮類成分峰面積的RSD在0.69%～1.27%之間，表明儀器精密度良好。

3.1.4 穩定性試驗

按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，每隔4小時進樣一次，連續進樣24小時，考察供試品穩定性。結果顯示，各甾酮類成分峰面積的RSD在0.86%～1.05%之間，表明樣品在24 h內穩定性良好。

3.1.5 重復性試驗

按“2.1.2.2”項下的方法平行制備6份供試品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件，進行重復性試驗。結果顯示，各甾酮類成分峰面積的RSD在0.54%～0.87%之間，表明方法重復性良好。

3.1.6 回收率實驗

精密稱定已知含量樣品約1 g，共6份，分別加入一定量的對照品溶液。按“2.1.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率。結果顯示，各甾酮類成分的平均加樣回收率在98.56%～101.38%之間，RSD小于1%(n=6)，表明方法的準確度良好。結果見表3。

表3 牛膝加樣回收率Table 3 Results of recovery test

續表3(Continued Tab.3)

3.2 甾酮類化學成分含量測定

21批牛膝甾酮類成分含量測定結果見表4，分析結果可知，甾酮類成分含量均符合藥典規定。但不同產地牛膝藥材的甾酮類含量有明顯的區別，且同一產地不同等級牛膝藥材含量也有略微不同。與市面上的商品等級分類有明顯區別，說明單靠形色來劃分牛膝等級存在一定的不足之處。

表4 21批牛膝的甾酮類成分的含量測定結果(n=3)Table 4 Phytoecdysones content determination for 21 batches of A.bidentata (n=3)(%)

續表4(Continued Tab.4)

3.3 抗氧化生物活性指標測定結果

21批牛膝藥材抗氧化生物活性指標測定結果見表5。分析結果可知，不同批次樣品生物活性均有不同程度的差異。以每批樣品中所測抗氧化指標的總和作為牛膝的總生物活性，同理得出總甾酮類成分含量。由圖2可知，甾酮類成分含量高的一級河北、統河北、河南差(S10、S9、S13)，在抗氧化性測定結果中均是較差的批次。這就表明牛膝藥材抗氧化能力與甾酮類成分含量不呈單純的線性關系。所以僅靠甾酮類成分難以全面反映牛膝整體質量。

表5 21批牛膝抗氧化生物活性測定結果(n=3)Table 5 Antioxidant biological activity for 21 batches of A.bidentata (n=3)

圖2 21批牛膝藥材的生物活性和含量測定結果Fig.2 Contents and biological activity for 21 batches of A.bidentata

3.4 牛膝等級劃分

3.4.1 主成分分析

PCA可對多變量的復雜信息進行快速的整合[12]。本研究將提取的數據(n=3)標準化處理后，導入Simca-p14.1軟件，得到散點圖(圖A)。由圖可以看出牛膝各批次樣品有明顯分類，且分類結果與原等級不相符。進而采用HCA聚類分析方法對各批數據進行分析，可見等級間有明顯的分類距離，結果見(圖B)。由成分載荷圖(圖C)可以看出，甾酮類成分和各抗氧化因子是影響牛膝藥材等級的主要因素。

3.4.2 等級預測結果

擬合選用的訓練集結果如下：優級為河南牛膝(S4)和中牛膝(S7)；良級為一級河南(S14)和河北牛膝(S3)；中級為一級河北(S10)和二級內蒙(S19)；差級為三級內蒙(S20)和河南差級(S9)；利用SPSS 22.0軟件得到模型表達式(見公式4～7)，將測試集實測值代入下式中計算各等級的概率，結果見表5。

P優=exp (-109.517-2.429*ABTS+0.029*DPPH+1.734*·OH+4 686.863*β-蛻皮甾酮含量+571.806*25R-甾酮含量-587.029*25S-甾酮含量)/[1+ exp (-109.517-2.429*ABTS+ 0.029*DPPH+1.734*·OH+4 686.863*β-蛻皮甾酮含量+571.806*25R-甾酮含量-587.029*25S-甾酮含量)]

(4)

P良=exp (-82.132+0.148*ABTS+6.211*DPPH-0.218*·OH-5 294.954*β-蛻皮甾酮含量-547.849*25R-甾酮含量+719.112*25S-甾酮含量)/[1+exp(-82.132+0.148*ABTS +6.211*DPPH-0.218*·OH-5 294.954*β-蛻皮甾酮含量-547.849*25R-甾酮含量+719.112*25S-甾酮含量)]

(5)

P中=exp (-246.277+2.325*ABTS-7.996*DPPH+0.086*·OH+1 896.384*β-蛻皮甾酮含量+638.24*25R-甾酮含量+480.29*25S-甾酮含量)/[1+exp (-246.277+2.325*ABTS-7.996*DPPH+ 0.086*·OH+1 896.384*β-蛻皮甾酮含量+638.24*25R-甾酮含量+480.29*25S-甾酮含量)]

(6)

P差=exp (286.408-3.501*ABTS-1.775*DPPH+1.739*·OH-2 470.817*β-蛻皮甾酮含量+146.848*25R-甾酮含量+53.502*25S-甾酮含量)/[1+exp (286.408-3.501*ABTS-1.775*DPPH+ 1.739*·OH-2 470.817*β-蛻皮甾酮含量+146.848*25R-甾酮含量+53.502*25S-甾酮含量)]

(7)

4 討論

4.1 制備方法考察

本研究對制備方法進行了考察，主要考察溶劑種類(正丁醇、乙醇、甲醇)、溶劑濃度(90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇)和提取方式(超聲提取、回流提取)三個方面。結果表明在提取充分的條件下，“2.1.2.2”項下制備方法便捷且效率高，故選用該制備方法。

4.2 色譜條件的選擇

本研究比較了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液和乙腈-0.2%乙酸水溶液三種洗脫系統的分離效果。結果表明，選擇0.2%乙酸-乙腈洗脫系統時，各峰分離度較好且基線平穩，故選擇此流動相。考察了美國沃世特公司的ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC?BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)兩種色譜柱，兩種色譜柱出峰靈敏度均較好，但ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱峰形更好，故選擇此色譜柱進行色譜分析。在波長方面，PDA檢測器分析結果顯示在250 nm波長下，各參照峰色譜圖信息較為完全。因此，選用250 nm作為檢測波長。

圖3 牛膝藥材聚類結果Fig.3 Clustering results of A.bidentata注：A.PCA散點圖；B.2HCA-聚類圖；C.成分載荷圖。Note:A.PCA scatter diagram;B.HCA-clustering diagram;C.Loading plot.

表6 牛膝藥材等級評價結果Table 6 Grade evaluation results of A.bidentata

4.3 牛膝藥材等級評價

2015版《中國藥典》規定牛膝中β-蛻皮甾酮的含量不得低于0.03%。由表3可知，所有藥材質量均達標。進一步的主成分分析結果表明，21批牛膝藥材質量存在明顯差異，且影響因素主要表現在甾酮類成分含量與各抗氧化因子上。在此基礎上建立一種基于“甾酮類化學成分-抗氧化生物活性”關聯研究的回歸模型。通過該模型，21批牛膝藥材被分成了優良中差四個等級。其中優級含有二級、三級河南等批次，良級含有一級河南、一級內蒙、三級河北等批次，中級含有一級河北、二級內蒙等批次，差級含有三級內蒙、統貨河北與河南等批次，分級結果與商品等級不全一致。目前市場上牛膝的等級主要依靠感官評價和傳統經驗，主觀性較強，難以標準化界定其質量。所以本研究認為基于Logistic回歸模型能夠更好地劃分牛膝藥材等級。

化學定性鑒別與指標成分檢測是現行中藥質量控制主要內容，而中藥是個復雜的體系，僅以化學成分描述其質量優劣顯然不夠全面。雖然已有學者建議將生物活性與化學成分關聯并用，從而更科學地評價中藥的內在質量[13]。但是目前仍缺乏合理的關聯方案，本研究通過Logistic回歸模型將“化學成分-生物活性”進行了有效的關聯，為牛膝的質量控制與評價提供了新的研究思路。